金 茜，趙 特，胡明華

(遵義師范學院，貴州遵義 563006)

花色苷是目前清除氧自由基和脂質(zhì)過氧化的抑制劑之一[1-9]，是一種天然色素，在歐美等國家已廣泛應用于醫(yī)藥和保健食品行業(yè)[10-11]。提取花色苷的方法有雙水相法、超聲波法、微波法、酶解法等[12-14]等。本試驗以恒溫水浴震蕩器為輔助儀器，采用溶劑提取法進行花色苷的提取，為楊梅葉資源綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：SHIMADZU AUX220 電子天平，日本島津；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-16G離心機，上海安亭科學儀器廠制造；SHA-B恒溫水浴震蕩器，金壇市科析儀器有限公司；FW135中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；ZK-82B真空干燥箱，天津天有利科技有限公司；pHS-3C型精密算度計，上海大普儀器有限公司。

試劑：無水乙醇(AR)、混合磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.86)、氯化鉀(AR)、濃鹽酸(AR)、乙酸鈉(AR)、pH1.0氯化鉀緩沖溶液、pH4.5乙酸鈉緩沖溶液，所有試劑均購自成都試劑廠。

1.2 材料

楊梅葉，2016年6月—2017年1月采摘于遵義，洗凈后晾干或低溫烘干，粉碎，避光保存。

1.3 楊梅葉中花色苷的提取方法

準確稱取一定量的楊梅葉粉末，以80%的乙醇為提取劑，鹽酸質(zhì)量分數(shù)為0.3%，在60℃的恒溫水浴震蕩器里浸提60min，于5 000r/min離心10min。

1.4 花色苷最大吸收光譜的測定

提取液用紫外可見分光光度計進行光譜掃描，測定楊梅葉中花色苷的最大吸收波長。由圖1可知，楊梅葉花色苷在520～550nm之間有明顯的吸收峰，在538nm處有最大吸收，故其最大吸收波長為538nm。

圖1 楊梅葉花色苷特征吸收光譜

1.5 pH示差法測定花色苷含量

在不同的pH條件下，花色苷會表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)，當pH=1.0時，花色苷以有色的黃烊鹽正離子的形式存在；當pH=4.5時，則以無色半酮縮醛形式存在。兩種物質(zhì)的吸光度有很大差別，但結(jié)構(gòu)都相對穩(wěn)定，故可用pH示差法測定花色苷的含量[15]。各取上清液1mL，分別加入氯化鉀緩沖溶液(pH1.0)和醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)各9mL，混合后平衡1h，用乙醇溶液作空白，在最大吸收波長λmax和700nm(校正渾濁度)處測得稀釋后樣品的吸光值。根據(jù)式(1)、(2)計算花色苷的含量。

花色苷濃度(mg/L)=[(Aλmax-Aλ700)pH 1.0-(Aλmax-Aλ700)pH 4.5]×Mw×DF×1 000/k

(1)

式(1)中，Mw—相對分子質(zhì)量；DF—樣品稀釋倍數(shù)；k—摩爾吸光系數(shù)。當k未知或樣品成分未知時，將矢車菊-3-葡萄糖苷作為標準物，此時Mw=449.2，k=26 900。

花色苷含量m(mg/g，DW)=C×V/m0

(2)

式(2)中，DW—樣品為干重狀態(tài)；V—浸提液體積；m0—樣品干重時的質(zhì)量。

2 單因素試驗與分析

2.1 乙醇濃度的選擇及對花色苷提取率的影響

由圖2可知，花色苷的提取率隨乙醇濃度的變化而改變，當乙醇濃度為80%時，花色苷提取率最高。

表1 花色苷提取率隨乙醇含量的變化

圖2 乙醇含量對花色苷提取量的影響

2.2 提取時間對花色苷提取率的影響

由圖3可知，當提取時間為60min時，花色苷的提取率達到最大，隨后花色苷的提取量下降。隨著提取時間的延長導致了其他成分含量的增加，且提取率下降，同時延長了試驗的時間，因此選取60min作為提取的最佳時間。

圖3 提取時間對花色苷提取量的影響

表2 花色苷提取率隨時間的變化

2.3 提取溫度對花色苷提取率的影響

由圖4可知，當溫度不斷升高，楊梅葉中花色苷的提取率不斷上升，當提取溫度達到60℃時提取率達到最大，并隨溫度的升高而急劇下降，與文獻[16]結(jié)果一致，可能是花色苷的結(jié)構(gòu)在較高的溫度環(huán)境下受到了破壞，因此提取花色苷的溫度應控制在60℃左右。

表3 花色苷提取率隨提取溫暖的變化

圖4 提取溫度對花色苷提取量的影響

2.4 料液比對花色苷提取率的影響

由圖5可知，隨著料液比的增加花色苷的提取率不斷上升，當料液比為1∶70時，花色苷的提取率趨于穩(wěn)定，因此選取的料液比為1∶70。

表4 花色苷提取率隨料液比的變化

圖5 料液比對花色苷提取量的影響

2.5 最佳鹽酸濃度對花色苷提取率的影響

由圖6可知，當鹽酸濃度為0.3%時，花色苷的提取率達到最大，當酸度過高時花色苷的提取率反而下降，可能是花色苷中的糖苷鍵水解導致色苷提取率下降[17]。因此試驗時選取0.3%的鹽酸濃度。

表5 花色苷提取率隨鹽酸濃度的變化

圖6 鹽酸體積分數(shù)對花色苷提取量的影響

2.6 最佳提取次數(shù)對花色苷提取率的影響

由圖7可知，當提取次數(shù)為1時，楊梅葉中花色苷的提取率最高，因此提取次數(shù)為1。

表6 花色苷提取率隨提取次數(shù)的變化

圖7 提取次數(shù)對花色苷提取量的影響

3 花色苷提取的多因素正交試驗

按照四因素三水平進行正交試驗L9(34)，對浸取時間、浸提溫度、乙醇含量、料液比4個因素進行優(yōu)選(表7、表8)。由極差(R)分析知，料液比對楊梅葉中花色苷的提取影響較大，其次是提取溫度和提取時間，影響最小的是提取劑濃度，即A>D>C>B，比較綜合各因素的 K 值，最佳提取工藝為料液比為1∶70、乙醇含量為80%、溫度為60℃、提取時間為60min，此條件下的提取率最高。

表7 正交試驗因素水平

表8 正交試驗結(jié)果

4 結(jié)論

楊梅葉花色苷最佳提取工藝為料液比為1∶70、乙醇含量為80%、溫度為60℃、提取時間為60min，此條件下的提取率最高。該提取方法操作簡單、方便、無污染。從楊梅葉中提取的花色苷粗產(chǎn)品可進一步純化，用于飲料、食品及醫(yī)藥中，為充分利用楊梅葉資源提供了參考依據(jù)?！?/p>