龔小見(jiàn)，蘇 敏，趙 超，周 欣*

(1.貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴州師范大學(xué) 貴州省藥物質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550001；3.貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550001)

近年來(lái)，各類(lèi)食品安全事件頻發(fā)，威脅人們健康和社會(huì)穩(wěn)定。農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中農(nóng)藥的使用會(huì)導(dǎo)致其殘留在農(nóng)作物體內(nèi)，當(dāng)農(nóng)藥富集到一定量后將會(huì)影響人體健康[1]。吡蟲(chóng)啉(Imidacloprid)是20世紀(jì)80年代由德國(guó)和日本農(nóng)藥公司共同開(kāi)發(fā)的一種內(nèi)吸、高效、殘效期長(zhǎng)的農(nóng)用優(yōu)良新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，化學(xué)名為1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基咪唑烷-2-亞胺，分子式為C9H10ClN5O2。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，廣泛用于種子、葉面和土壤中多種害蟲(chóng)的防治[2-3]。吡蟲(chóng)啉會(huì)使人產(chǎn)生嗜睡、心悸、嘔吐、頭暈和定向障礙，嚴(yán)重者導(dǎo)致心率過(guò)緩及心肺驟停[4]，并具有基因毒性和免疫毒性等嚴(yán)重的毒副作用[5-6]。因此，分析吡蟲(chóng)啉在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程和代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)可為合理安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

目前關(guān)于吡蟲(chóng)啉在果蔬以及土壤中的殘留檢測(cè)報(bào)道較多，分析方法主要包括高效液相色譜法[7-10]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-14]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]，但對(duì)吡蟲(chóng)啉在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程研究較少。本文對(duì)SD雄性大鼠灌胃68.1mg·kg-1吡蟲(chóng)啉(10% LD50值)[16]，采用甲醇直接沉淀蛋白質(zhì)的方法處理血漿樣品，建立了HPLC測(cè)定大鼠血漿中吡蟲(chóng)啉含量的方法。同時(shí)采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件(DAS2.0軟件)對(duì)吡蟲(chóng)啉灌胃給藥后大鼠的平均血藥濃度～時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，初步掌握了吡蟲(chóng)啉在動(dòng)物體內(nèi)的變化規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DIONEX Ultimate3000型高效液相色譜儀(包括四元泵處理器、自動(dòng)進(jìn)樣器、RS柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器以及 Chromeleon7.2色譜工作站)，TGL-16M型離心機(jī)(長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司)，XS105DU型十萬(wàn)分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，EYELAMG-2200型氮?dú)獯蹈蓛x(日本東京理化器械株式會(huì)社)。

吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，貴州迪大科技有限責(zé)任公司)；肝素鈉(貴州迪大科技有限責(zé)任公司)，以蒸餾水配制成1000IU/mL；甲醇(色譜純，Tedia公司)；甲醇(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；生理鹽水(貴州科倫藥業(yè)有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為自制蒸餾水。

雄性SD大鼠(長(zhǎng)沙市天勤生物有限公司)，體重為150～250g，SPF級(jí)，許可證號(hào):SCXK(湘)2015-0011。

1.2 儀器工作條件

色譜柱為Agilent ZORBAX C18柱(4.6mm×250mm，5μm )，流動(dòng)相為甲醇-水(30∶70)，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm，流速1.0mL/min，柱溫為室溫。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1對(duì)照品溶液的配制精密稱(chēng)取2.0 mg吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)品，用適量甲醇溶解并定容至10 mL，配成0.2 g/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)以甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.3.2供試品的制備取100 μL血漿樣品置于1.5 mL離心管中，加入400 μL甲醇，渦旋1.0 min充分混勻，在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，取上清液于1.5 mL空白離心管中，以40 ℃氮?dú)獯蹈?，殘留物加?00 μL甲醇，渦旋振蕩混合30 s，4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣?？瞻籽獫{按上述方法處理。

1.3.3吡蟲(chóng)啉的代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)隨機(jī)選取6只健康雄性SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，灌胃給藥68.1 mg·kg-1吡蟲(chóng)啉，在給藥前5 min和給藥后0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、12.0、15.0、18.0、20.0、24.0 h，經(jīng)眼眶取血0.5 mL，用肝素鈉抗凝的離心管采集血樣，血樣在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，分離血漿置于空白離心管中，于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白沉淀劑的選擇

分別考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮作為蛋白沉淀劑的效果，發(fā)現(xiàn)丙酮作蛋白沉淀劑時(shí)對(duì)色譜峰有干擾，且操作繁瑣；乙醇、乙腈為蛋白沉淀劑時(shí)的平均回收率低于甲醇，甲醇為蛋白沉淀劑的平均回收率為74.7%，因此選擇甲醇作為蛋白沉淀劑。

2.2 流動(dòng)相的選擇

考察了甲醇-水和乙腈-水體系為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，結(jié)果表明，兩種流動(dòng)相均能將吡蟲(chóng)啉與基質(zhì)干擾峰分開(kāi)?？紤]到成本及環(huán)保等因素，最終選擇甲醇-水作為流動(dòng)相，其最優(yōu)體積比為30∶70。

圖1 空白加標(biāo)血漿(100 mg·L-1)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the blank spiked(100 mg·L-1) plasma

2.3 方法專(zhuān)屬性

取空白血漿，按照“1.3.2”方法處理，精密取20 μL進(jìn)樣，得空白血漿的HPLC圖；取空白血漿，精密加入100 μL質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的吡蟲(chóng)啉對(duì)照品，采用上述方法處理，得加標(biāo)血漿樣品的HPLC圖。由圖可知，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾吡蟲(chóng)啉的測(cè)定，被測(cè)物的色譜峰形良好(圖1)。

2.4 線性范圍、檢出限及定量下限

取SD大鼠空白血漿8份，每份100 μL，分別加入標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照品溶液，渦旋1.0 min，按照“1.3.2”方法操作，配成吡蟲(chóng)啉質(zhì)量濃度為0.5、2.5、10、20、40、80、100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣分析。以吡蟲(chóng)啉的質(zhì)量濃度(X，mg·L-1)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。吡蟲(chóng)啉在0.5～100 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.322 6X-0.228 8(r2=0.999 8)。以目標(biāo)化合物與其附近基線噪音的比值(S/N)確定檢出限(S/N=3)及定量下限(S/N=10)，得血漿樣品中吡蟲(chóng)啉的檢出限為10 μg·L-1，定量下限在100 μg·L-1以?xún)?nèi)。

2.5 提取回收率

精密取SD大鼠空白血漿100 μL，配制吡蟲(chóng)啉質(zhì)量濃度為10、15、20 mg·L-1，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品各3份，按照“1.3.2”方法處理；同法配制吡蟲(chóng)啉質(zhì)量濃度為10、15、20 mg·L-1的對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度各3份，過(guò)0.45 μm濾膜后取20 μL進(jìn)樣。以空白加標(biāo)血漿樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積比值計(jì)算回收率，得吡蟲(chóng)啉的平均回收率為74.7%。

2.6 精密度

精密吸取空白血漿100 μL，加入不同質(zhì)量濃度的吡蟲(chóng)啉對(duì)照品溶液100 μL，分別配制成10、15、20 mg·L-13個(gè)水平的質(zhì)控樣品，按照“1.3.2”方法處理，分別連續(xù)進(jìn)樣3次計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間RSD。結(jié)果表明，樣品的日內(nèi)RSD不大于5.4%，日間RSD不大于6.2%，符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的規(guī)定。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制100 μL質(zhì)量濃度分別為10、15、20 mg·L-1的吡蟲(chóng)啉加樣血漿各9份，3份在室溫下放置24 h后按照“1.3.2”方法處理和分析，考察樣品在室溫下的穩(wěn)定性；3份于-20 ℃冰凍，取出融解，反復(fù)凍融3次后同法處理和分析，考察樣品的3次凍融穩(wěn)定性；3份于-20 ℃冰凍半個(gè)月后取出自然解凍，同法處理和分析，考察樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。所得結(jié)果的RSD為3.7%～9.6%，表明樣品的穩(wěn)定性較好。

圖2 吡蟲(chóng)啉的血藥濃度～時(shí)間曲線Fig.2 Concentration-time curve of imidacloprid in plasma

2.8 吡蟲(chóng)啉在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

按照“1.3.3”方法取100 μL血漿樣品，采用“1.3.2”方法處理后進(jìn)行測(cè)定。所得結(jié)果采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件(DAS 2.0版軟件)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，繪制動(dòng)力學(xué)曲線(圖2)，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 吡蟲(chóng)啉的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 The pharmacokinetic parameters of imidacloprid

結(jié)果表明，分布半衰期(t1/2α)小于消除半衰期(t1/2β)，說(shuō)明吡蟲(chóng)啉在大鼠體內(nèi)分布較快，主要以消除為主；達(dá)峰時(shí)間(tmax)為7.333 h，達(dá)峰血藥濃度(Cmax)為23.557 mg/L，藥時(shí)曲線下面積(AUC(0-t))為276.727 mg·h/L，表觀分布容積(Vd)為842.796 L/kg，清除率(CL)為137.991 L/(h·kg-1)，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明吡蟲(chóng)啉在大鼠體內(nèi)吸收慢，達(dá)峰時(shí)間長(zhǎng)，血藥濃度高，體內(nèi)分布廣，消除速率快；K21大于K12，表明吡蟲(chóng)啉從周邊室向中央室轉(zhuǎn)運(yùn)的速率大于從中央室向周邊室轉(zhuǎn)運(yùn)的速率，說(shuō)明吡蟲(chóng)啉主要分布在血液和血流豐富組織中。綜上所述，吡蟲(chóng)啉在大鼠體內(nèi)呈二隔室模型分布，以一級(jí)藥代動(dòng)力學(xué)方式消除。

3 結(jié) 論

本文建立了測(cè)定大鼠血漿中吡蟲(chóng)啉含量的RP/HPLC方法，該方法前處理簡(jiǎn)單、回收率較高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便，可用于生物樣品中吡蟲(chóng)啉含量的測(cè)定。采用所建立的方法研究了SD大鼠灌胃給藥量為68.1 mg·kg-1(10%LD50)吡蟲(chóng)啉的藥代動(dòng)力學(xué)行為，測(cè)定了不同時(shí)間下血漿中吡蟲(chóng)啉的濃度，并擬合計(jì)算了給藥后大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為吡蟲(chóng)啉的合理安全用藥提供了科學(xué)依據(jù)。