李 莉，萬子彥，周 穎，張 闖，崔紅艷，熊肖男，鐘家棋，李宗豪，吳 真，袁鳳鳴，秦雅茹，張 明

(南京醫(yī)科大學 康達學院，江蘇 連云港 222000)

毛發(fā)的主要成分為角蛋白，經(jīng)水解后可得到游離的氨基酸。與血液、尿液等其它生物檢材相比，毛發(fā)具有易于收集、無損機體、樣品穩(wěn)定、處理簡單等優(yōu)點[1]，可作為病因輔助診斷的生物檢材，具有一定的臨床應用價值。已有研究證明，某些疾病與毛發(fā)蛋白中氨基酸組成的改變密切相關[2-4]。Min等[3]研究發(fā)現(xiàn)人發(fā)可作為診斷糖尿病的非侵入性生物樣本。缺硫脆發(fā)病患者頭發(fā)的含硫氨基酸(胱氨酸或蛋氨酸)含量較正常人低[5-6]。Lynch等[7]發(fā)現(xiàn)患脫發(fā)綜合癥的澳洲海豹毛發(fā)中的酪氨酸和鋅的濃度比正常健康的海豹明顯降低。Geetha研究小組[8]發(fā)現(xiàn)自閉癥兒童頭發(fā)和指甲蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的硝化程度與自閉癥的嚴重程度密切相關。Strnad等[9]的研究表明頭發(fā)角蛋白中過量的組氨酸與基因突變導致的疾病有關。

由于毛發(fā)角蛋白中的胱氨酸、酪氨酸和組氨酸均與疾病相關，因此開發(fā)毛發(fā)角蛋白中胱氨酸、酪氨酸和組氨酸的分析方法具有重要意義。目前關于毛發(fā)角蛋白中氨基酸的檢測方法主要包括經(jīng)TMS(三甲基硅基團)衍生化/氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[2,10-11]、衍生化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS/MS)[4]、柱前衍生化/高效液相色譜法(HPLC)[12]等。但上述方法存在衍生試劑昂貴、衍生步驟繁瑣、耗時及需要昂貴的特殊儀器等不足，從而限制了其廣泛使用。在反相高效液相色譜中應用離子對試劑分離親水性物質(zhì)已有一定的研究基礎[13-17]。由于游離氨基酸的可離子化性質(zhì)，可通過在流動相中加入離子對試劑增強氨基酸離子化合物在色譜柱上的保留，從而改善分離效果[18-19]。

本文建立了無需柱前衍生的同時直接測定大鼠毛發(fā)中胱氨酸、酪氨酸和組氨酸的離子對反相高效液相色譜法。該方法簡便快捷、穩(wěn)定可靠、專屬性強，可為毛發(fā)在臨床疾病輔助診斷中的應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Waters高效液相色譜儀(含PDA檢測器，Breeze2色譜工作站)；AT-950型色譜柱溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；日本島津AUW220D型電子天平；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)。

胱氨酸標準品(純度99.0%)、組氨酸標準品(純度100.0%)，上海麥克林生化科技有限公司；酪氨酸標準品、辛烷磺酸鈉(純度均為99.0%，薩恩化學技術上海有限公司)；乙腈(色譜純，Tedia公司)；磷酸氫二銨、磷酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。實驗用水為超純水(電阻率為18.2MΩ·cm，25℃)。

大鼠毛發(fā)樣品:由南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心提供，共9例。

1.2 色譜條件

色譜柱:Titank C18(4.6mm×250mm×5μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司)。流動相:A為10mmol/L磷酸氫二銨(含10mmol/L1-辛烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)至pH2.0)，B為乙腈；梯度洗脫程序:0～5min，95% A；5～6min，95%～86% A；6～15min，86% A；15～16min，86%～87% A；16～34min，87% A；34～35min，87%～50% A；35～40min，50% A；40～41min，50%～95% A；41～48min，95% A。流速為1.0mL/min，檢測波長為205nm，進樣量為100μL，柱溫為8℃。

1.3 實驗方法

1.3.1標準儲備溶液的配制精密稱取胱氨酸、組氨酸和酪氨酸標準品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的標準儲備液。臨用時，以水逐級稀釋至所需質(zhì)量濃度的系列標準溶液。

1.3.2標準工作溶液的配制混合標準儲備溶液:精密稱取胱氨酸標準品125 mg、組氨酸標準品15 mg和酪氨酸標準品50 mg，置于250 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得胱氨酸、組氨酸、酪氨酸質(zhì)量濃度分別約為500、60、200 mg/L的混合標準儲備溶液。

混合標準工作溶液:準確量取上述混合標準儲備溶液0.5、2.5、5.0、7.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，制得混合標準工作溶液Ⅰ(胱氨酸25 mg/L、組氨酸3 mg/L、酪氨酸10 mg/L)、Ⅱ(胱氨酸125 mg/L、組氨酸15 mg/L、酪氨酸50 mg/L)、Ⅲ(胱氨酸250 mg/L、組氨酸30 mg/L、酪氨酸100 mg/L)、Ⅳ(胱氨酸375 mg/L、組氨酸45 mg/L、酪氨酸150 mg/L)，混合標準儲備溶液作為混合標準工作溶液Ⅴ(胱氨酸500 mg/L、組氨酸60 mg/L、酪氨酸200 mg/L)。

1.3.3樣品處理取大鼠毛發(fā)若干，用1%的洗潔精超聲振蕩10 min，重復洗滌3次。用超純水將毛發(fā)樣品上的洗潔精漂洗干凈，置于減壓干燥器中干燥，然后用剪刀剪碎(約2 mm)。

精密稱取洗凈的毛發(fā)樣品100 mg，置于20 mL不銹鋼水熱合成反應釜中，加入6 mol/L的鹽酸8 mL，110 ℃水解16 h[20]，取水解液2 mL，用20 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH 2.0后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.3.4測定精密量取混合標準工作溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ與供試品溶液各100 μL進行液相色譜分析，分別以胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標，對應的峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。按照標準曲線法以峰面積計算供試品中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的濃度。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇胱氨酸、組氨酸和酪氨酸為親水性物質(zhì)，在HPLC的梯度洗脫中，通過增加水相的比例可以延長分析物在色譜柱中的保留時間。但普通的C18柱不能耐受100%的水溶液，因此本方法選用可在100%水溶液條件下穩(wěn)定使用的Titank C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，其耐受的pH值范圍為1.0～12.0。

2.1.2檢測波長的選擇采用二極管陣列檢測器全波長掃描模式，在190～400 nm波長范圍內(nèi)分別對胱氨酸、組氨酸和酪氨酸進行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)胱氨酸在紫外區(qū)只有末端吸收，組氨酸在212 nm處有最大吸收峰，酪氨酸在223、276 nm處有最大吸收峰。為降低乙腈在低波長的干擾，同時考慮到PDA檢測器響應值，最終采用205 nm波長進行測定。

2.1.3流動相及其pH值的確定實驗發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水為流動相時目標分析物在4 min前全部出峰；在流動相中加入10 mmol/L磷酸氫二銨和10 mmol/L離子對試劑1-辛烷磺酸鈉后，目標分析物的保留時間延長，分離效果得到明顯改善，因此選擇流動相A為10 mmol/L磷酸氫二銨溶液(含10 mmol/L 1-辛烷磺酸鈉)，B為乙腈。

對流動相A的pH值進行優(yōu)化，用磷酸調(diào)節(jié)其pH值為1.5～3.0，對供試品溶液進行分析。結果顯示，流動相A的pH值會影響目標分析物的分離效果，當pH值為2.0時，胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的分離效果最好。因此確定洗脫液A的pH值為2.0。

2.1.4流速的確定考察了流速(0.9、1.0、1.1 mL/min)對樣品中目標分析物分離效果的影響。結果顯示，隨著流速的增加，目標分析物的出峰時間顯著縮短，綜合考慮分離效果及分析時間，選擇最佳流速為1.0 mL/min。

在最佳色譜條件下，胱氨酸、組氨酸和酪氨酸均能夠完全分離，其標準色譜圖見圖1A。

2.2 方法學驗證

2.2.1工作曲線、檢出限與定量下限分別精密量取混合標準工作溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，按照“1.2”色譜條件進行測定。分別以胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標，對應的峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸。結果表明，胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的線性范圍分別為25～500 mg/L、3～60 mg/L和10～200 mg/L，相關系數(shù)分別為0.999 9、0.999 6和0.999 9(表1)。

分別將胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的標準儲備液(1 000 mg/L)稀釋成一系列的質(zhì)量濃度，按照“1.2”色譜條件依次進樣，以信噪比(S/N)為10考察其定量下限(LOQ)，得三者的定量下限分別為330、148、884 μg/L;以S/N=3考察其檢出限(LOD)，得三者的檢出限分別為110、49、442 μg/L。本方法具有良好的線性范圍和靈敏度，適用于大鼠毛發(fā)中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的定量檢測。

表1 胱氨酸、組氨酸與酪氨酸的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量下限Table 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of cystine,histidine and tyrosine

2.2.2重復性與穩(wěn)定性取同一批大鼠毛發(fā)樣品，按“1.3.3”方法平行制備6份供試品溶液。采用“1.2”色譜條件測定，按照標準曲線法分別計算大鼠毛發(fā)樣品中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的含量。結果表明，上述3種氨基酸的平均含量分別為118.6、13.1、33.0 mg/g，相對標準偏差(RSD)分別為0.2%、0.3%和0.6%，表明本方法的重復性良好。

取同一批大鼠毛發(fā)樣品，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，分別在放置0、2、4、8、12、16、20、24 h后，按照“1.2”色譜條件進樣測定，胱氨酸、組氨酸和酪氨酸峰面積的RSD分別為0.5%、0.6%和0.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3加標回收率按“1.3.3”方法制備供試品溶液9份，平分為3組，每組分別添加3個水平的混合標準工作溶液，然后用水定容至刻度，搖勻。按照“1.2”色譜條件進樣測定，每個水平平行測定6次。結果表明，在不同加標水平下胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的平均回收率為97.8%～102%，RSD為0.1%～1.6%(表2)，表明本方法準確度高、精密度好，能夠滿足大鼠毛發(fā)中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的測定要求。

表2 樣品的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs for analytes(n=6)

表3 實際樣品的測定結果Table 3 Analytical results for the real samples w/(mg·g-1)

2.3 實際樣品的測定

采用本文建立的方法，隨機選取8只大鼠進行檢測。以標準曲線法將峰面積代入回歸方程，計算大鼠毛發(fā)中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的含量，圖1B為1#樣品的色譜圖。測得樣品中胱氨酸的含量為105.5～124.6 mg/g，組氨酸的含量為12.9～16.3 mg/g，酪氨酸的含量為33.4～44.8 mg/g(表3)。實際樣品測定結果表明，該法可用于大鼠毛發(fā)中上述3種氨基酸的同時分析。

3 結 論

本文建立了直接同時檢測大鼠毛發(fā)中胱氨酸、組氨酸和酪氨酸的HPLC分析方法。該方法簡便快捷，結果準確，且避免了復雜的衍生化操作以及昂貴儀器的使用，具有較好的實際應用價值，有望為毛發(fā)在疾病輔助診斷方面的應用提供技術支持。