戴 斌，彭 琳，羅繼全，李宗祥，王 玲,焦榮華，楊賽男*

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學院，湖南 衡陽 421000；2.湖南省醫(yī)療器械檢驗檢測所，湖南 長沙 410000；3.三諾生物傳感股份有限公司，湖南 長沙 410000)

比色法是一種常用的定量檢測方法，其原理是通過分光光度計等設(shè)備測定光吸收率，再根據(jù)朗伯比爾定律進行濃度換算，但其檢測設(shè)備笨重，不適合檢測物的實時現(xiàn)場檢測。近年來，基于圖像比色的方法得到發(fā)展，該法可直接利用圖像進行定量，已有研究利用掃描儀[1-3]、數(shù)碼相機[4-6]、CCD攝像頭[7-9]、智能手機[10-12]等進行物質(zhì)濃度的檢測，分析對象包括金屬離子[13-14]、葡萄糖[15-16]、亞硝酸鹽[17]、甲醛[18]、鏈霉素[19]等。其中，智能手機由于集成了前后攝像頭、多核處理器等模塊，具有強大的圖像采集和分析處理能力，且便攜性高，大大提高了檢測系統(tǒng)的便攜性與操作性。

圖像比色法先利用設(shè)備獲取反應(yīng)體系的圖像，再提取圖像的原始信息并進行處理，最終得到可用于定量的參數(shù)再進行濃度換算。根據(jù)圖像色彩模式，圖像的原始信息可分為RGB[13,19-20]、HSV[21-22]、CMYK[2,23]3種，其中，RGB模式的應(yīng)用最廣泛，本研究采用RGB色彩模式。該模式認為任一顏色可由紅色(R)、綠色(G)和藍色(B)三原色合成，因此，任何顏色均可提取出R、G、B值，如白色的RGB為255、255、255，黑色的RGB為0、0、0。獲得圖像的原始R、G、B值后，關(guān)鍵在于確定用于濃度換算的參數(shù)。有研究者直接利用原始信息中某一分量，如R值或G值或B值作為定量參數(shù)[18-19,24-28]，或者對原始信息進行處理得到定量參數(shù)，如灰度[8,29-30]、歐式距離[1,13,31]等。但這些參數(shù)有局限性，使用單一分量僅適用于某些特定顏色的分析體系，且現(xiàn)有定量參數(shù)易受環(huán)境影響，從而限制了智能手機定量檢測技術(shù)的應(yīng)用推廣。本文以蛋白質(zhì)的檢測為例，確定了一種新的用于圖像比色的定量參數(shù)，提高了圖像比色的準確性和適用性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、氫氧化鈉(分析純，阿拉丁公司)；人血清蛋白(南岳生物制藥有限公司)。分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，超純水機(美國艾科浦國際有限公司)，LED屏(深圳神牛器材LEDP120c)，測光儀(蘇州特安斯 TASI-8700)，華為610s手機、華為G9手機、華為P9手機、魅族NOTE2手機、小米紅米手機、iphone4S手機、iphone6手機、中興CV19手機。

圖1 手機定量測試平臺Fig.1 Quantitative test platform based on smart phone

圖2 12種濃度蛋白質(zhì)的反應(yīng)體系照片F(xiàn)ig.2 Reaction system images of 12 protein concentrations

1.2 雙縮脲試劑與標準溶液的配制

雙縮脲試劑用超純水配制，其余物質(zhì)濃度：氫氧化鈉0.6mol/L、酒石酸鉀鈉32mmol/L、碘化鉀20mmol/L、硫酸銅12mmol/L。

標準溶液：利用生理鹽水對人血清蛋白進行稀釋，配成質(zhì)量濃度分別為0、3.1、4.7、6.3、9.4、12.5、18.8、25、37.5、50、75、100g/L的白蛋白溶液。

1.3 實驗過程

檢測樣本與雙縮脲試劑的體積比為3∶100，將混合液裝入干凈的比色皿中，蓋上硅膠塞。反應(yīng)5min后，將其放置在手機圖像采集位或利用分光光度計進行檢測。

分光光度計：波長540nm。手機拍照設(shè)置：關(guān)閉閃光燈，自動白平衡，其他參數(shù)均設(shè)為自動。

智能手機采集裝置見圖1，其中圖像采集位為六邊形框，手機與圖像采集位的距離可前后調(diào)整。LED屏置于圖像采集位后方，可使比色皿各處的光照一致。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗參數(shù)的確定

以LED屏作為背景光源，將12個質(zhì)量濃度的蛋白標準溶液依次加至檢測液中，從低濃度至高濃度分別用S1～S12表示。反應(yīng)后利用華為610s手機采集對應(yīng)的圖像，LED屏調(diào)節(jié)色溫為4500K，亮度為18000Lux，拍攝距離為13cm。不同濃度的蛋白反應(yīng)后會呈現(xiàn)不同的顏色，且顏色越深代表該樣品的濃度越高(圖2)。

利用Photoshop軟件提取圖像中比色皿的顯色區(qū)域及其上方空白區(qū)域的R、G、B值。各有色區(qū)域的R、G、B值與空白區(qū)域的R0、G0、B0值見表1。

表1 比色皿顯色區(qū)域與空白區(qū)域的R、G、B值Table 1 The values of R,G and B in chromogenic area and blank area of cuvette

圖3 各分量(A)、灰度值(B)、特征吸光度(C)與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationships between concentration and R,G,B components(A)，gray value(B),absorbance(C)

已有研究多利用三原色中某一分量值進行運算，本實驗利用表1的各單一分量(y)與質(zhì)量濃度(x,g/L)進行線性擬合(圖3A)，發(fā)現(xiàn)G分量與質(zhì)量濃度存在較好的線性關(guān)系，但不同顏色的反應(yīng)體系，某一分量不能通用。將圖像三原色按式(1)轉(zhuǎn)換成灰度后可不受某單一分量的影響。

Gray=0.3R+0.59G+0.11B

(1)

將灰度值與質(zhì)量濃度進行線性擬合(圖3B)，結(jié)果顯示灰度值可通用于不同顏色的反應(yīng)體系，但其線性相關(guān)系數(shù)低于單用G分量擬合的相關(guān)系數(shù)。為進一步提高其線性相關(guān)性，將灰度值轉(zhuǎn)換成特征吸光度。根據(jù)朗伯-比爾定律定量(公式2)，在一定范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與吸光度存在線性關(guān)系。圖片中無法得到光強，但光強與灰度呈相關(guān)關(guān)系，光強越大，灰度值越高。直接利用灰度值替代光強，以比色皿上方空白區(qū)域的灰度值作為入射光強度，以比色皿有色區(qū)域的灰度值作為透射光強度。將灰度值經(jīng)公式(3)轉(zhuǎn)換成特征吸光度，即本文所確定的定量參數(shù)。

A=-lg(I/I0)=kbC

(2)

A=-lg(Gray/Gray0)

(3)

其中I為透射光強度，I0為入射光強度，k為物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，b為檢測池厚度，C為物質(zhì)的濃度，Gray為反應(yīng)區(qū)域的灰度，Gray0為空白區(qū)域的灰度。

轉(zhuǎn)換后特征吸光度與質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)達0.998(圖3C)，且通用于不同顏色的反應(yīng)體系。將手機測試梯度與分光光度計測試梯度進行對比(圖4)，發(fā)現(xiàn)手機的檢測梯度小，但線性相關(guān)性與分光光度計相當。而分光光度法采用反應(yīng)體系的最佳波長進行檢測，且使用了強光源(氙燈或鹵素燈)，其梯度更大，表明手機具有較好的檢測性能，且相比于分光光度法，其成本更低、更便攜，且各種顏色體系均可直接測試，無需設(shè)置特定波長。同時，由于利用比色皿空白區(qū)域作為對照，無需設(shè)置空白對照組即可進行檢測。

圖4 手機與分光光度計的檢測梯度比對Fig.4 Comparison of mobile phone test gradients and spectrophotometer test gradients

2.2 檢出限

將生理鹽水作為空白樣本，利用華為610s手機進行20次重復(fù)測試，得到空白樣本的測試均值(AV)與標準差(SD)，按照檢出限LOD=AV+2SD計算，得到該方法的檢出限為0.21g/L。

2.3 不同手機品牌的測試

選取華為610s、華為G9、華為P9、魅族NOTE2、小米紅米、iphone4S、iphone6、中興CV198款手機進行血清蛋白濃度的檢測，將獲得的圖像轉(zhuǎn)換成特征吸光度進行處理，LED屏調(diào)節(jié)色溫為4500K，亮度為18000Lux，拍攝距離為13cm。8款手機的參數(shù)及測試結(jié)果如表2所示。

表2 8款手機的參數(shù)及測試的線性關(guān)系Table 2 The parameters and linear correlations of 8 mobile phones

結(jié)果表明，采用不同品牌的手機檢測不同濃度的蛋白標準液，均呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，可用于定量檢測。但各手機之間的測試梯度有明顯區(qū)別，其中梯度最大的為中興CV19，而其攝像頭僅為30萬像素，梯度最小的為華為P9，為雙攝像頭，線性相關(guān)系數(shù)最高的是華為610s。表明手機硬件與測試結(jié)果并無明顯關(guān)聯(lián)，可能是各手機內(nèi)置的成像算法所致。

2.4 測試的重復(fù)性

利用華為610s作為檢測手機，LED屏調(diào)節(jié)色溫為4500K，亮度為18000Lux，拍攝距離為13cm。對11.8、31.1、85.4g/L的樣本進行重復(fù)測試，每個質(zhì)量濃度樣本重復(fù)測試10次。相對標準偏差(RSD)分別為11.9%、4.6%、2.0%，該檢測方法顯示了較好的重現(xiàn)性。

對12.5、23.8、38.1、77.9g/L的樣本進行同時檢測，RSD分別為11.5%、3.5%、3.8%、2.2%，表明該檢測方法可實現(xiàn)多樣本的同時檢測。

2.5 影響因素的考察

手機采集圖像時，易受光照與拍攝距離等外界環(huán)境的影響。利用華為610s作為檢測手機，固定色溫為4500K，拍攝距離為13cm，利用LED屏模擬5種光照強度，以光照儀測試光照強度分別為7300、13000、18000、24500、34000Lux。考察了上述光照強度對高、中、低3種濃度樣本檢測的影響，并以光強18000Lux為對照。結(jié)果顯示，高、中、低3種濃度樣本在其他4種光照強度下的測試結(jié)果與對照的最大相對偏差分別為5.1%、-7.8%、-6.8%，光照強度對檢測結(jié)果無明顯影響。

固定光照強度為18000Lux，拍攝距離為13cm，考察了不同色溫(3300、3900、4500、5000、5600K)對3種質(zhì)量濃度樣本檢測的影響，并以色溫4500K為對照。結(jié)果顯示，3種質(zhì)量濃度的樣本在其他4種色溫下的測試結(jié)果與對照的最大相對偏差分別為4.6%、-6.4%、-10.4%，表明色溫對檢測無明顯影響。

圖5 拍攝距離對測試的影響Fig.5 Influence of detection distance on mobile phone test

光照強度與色溫對檢測均無明顯影響，是由于將圖像RGB轉(zhuǎn)換成吸光度時，讀取了顯色區(qū)域與空白區(qū)域的信息。光照對于顯色區(qū)域與空白區(qū)域的影響一致，可相互抵消。

固定色溫4500K，光照強度18000Lux，考察了88g/L的樣本在13種不同拍攝距離(5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29cm)時的檢測結(jié)果，以拍攝距離13cm為對照(見圖5)。結(jié)果顯示，其他拍攝距離下的測試結(jié)果與對照的最大相對偏差為-30.3%，在測試距離大于20cm后，測試結(jié)果呈明顯偏差，且隨著距離的增加偏差增大。可能是由于距離增加后，測試結(jié)果受到手機相機定焦的影響。實際應(yīng)用時，需固定拍攝距離。

圖6 定量檢測的APP界面Fig.6 Interface of APP for quantitative detection

2.6 APP的比對試驗

智能手機擁有強大的計算能力，因此開發(fā)APP應(yīng)用，利用智能手機進行圖像處理與運算，可直接進行定量檢測。APP應(yīng)用界面如圖6所示。打開APP采集圖像后，進行兩次取值，第一次取值為空白區(qū)域的RGB值，第二次取值為顯色區(qū)域的RGB值，點擊計算，即可得到測試樣本的濃度值。

利用華為610s作為檢測手機，同時利用分光光度計分別對25個未知樣本進行檢測。測試結(jié)果顯示，手機的測試值與分光光度計測試值的相關(guān)系數(shù)(r2)為0.969，兩者測試結(jié)果相近，表明直接利用智能手機進行定量檢測的結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

本文確定了一種新的圖像比色參數(shù)，先將圖像中比色皿的顯色區(qū)域和空白區(qū)域的三原色轉(zhuǎn)換成灰度值，再進一步轉(zhuǎn)換成特征吸光度。該參數(shù)的通用性強，適用于不同顏色反應(yīng)體系的檢測，且光強與色溫的影響小。利用手機APP可直接在手機上完成檢測，重復(fù)性好、測試準確，且可以同時進行多個樣本的檢測。由于該方法的便攜性與準確性，在食品、環(huán)境、健康的現(xiàn)場實時檢測中有很大的應(yīng)用前景。但該參數(shù)在不同手機上使用時存在差異，后期需優(yōu)化以提高其適用性。