金志民，柴軍紅，何婷婷，景云榮

(牡丹江師范學(xué)院，黑龍江牡丹江157011)

東北茶藨子(Ribesmandshuricum),又名燈籠果、虎耳草科，茶藨屬灌木[1-2]。青果多汁味酸，富含維生素C[3]、山柰酚及衍生物、多糖、有機(jī)酸[4]等多種藥理活性成分，其中黃酮成分對(duì)炎癥因子抑制效果好，富含維生素C、多酚、多糖物質(zhì)，所以有一定抗氧化、抗疲勞作用[5-6]，也具有潛在抗腫瘤活性[7]。此外還具有一定的降血糖、降血脂、提高耐力、抗病毒等[7-8]，因此有必要進(jìn)一步研究其提取工藝?，F(xiàn)階段研究主要集中葉片總酚、總黃酮工藝研究[9]，功能飲料研制[10]，對(duì)于果實(shí)研究較少，所以有一定的應(yīng)用價(jià)值。

本文以牡丹江產(chǎn)東北茶藨子(Ribesmandshuricum)為原料，以總黃酮及多糖為指標(biāo)，借助正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝，希望為東北茶藨子開發(fā)利用、活性成分提取純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

葡萄糖、濃硫酸(AR，上海國藥集團(tuán))，無水乙醇、甲醇(AR,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，蘆丁對(duì)照品>99%(貴州迪大生物技術(shù)公司)，苯酚(AR，沈陽試劑五廠)，硝酸鋁(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司)，纖維素酶R-10和果膠酶(WOLSEN,日本)等。

1.2 主要儀器

JHH-4四孔數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)，JJ-2型組織搗碎機(jī)勻漿機(jī)(武漢世紀(jì)超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，T6紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，BS214D電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SL-2010N超聲波萃取裝置(南京順流設(shè)備有限公司)等。

1.3 活性成分測定方法

1.3.1 總黃酮測定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線：依據(jù)文獻(xiàn)[9]配制1mg/mL母液，再分別精確配制0.1～0.7mg/mL，待測溶液，在505nm波長下，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[11]，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：提取液回收溶劑，濃縮并真空干燥，取適量，用少量甲醇超聲溶解，取80%甲醇定容至100mL容量瓶中，移取上清1mL母液于25mL比色管依據(jù)以上方法測定含量。

1.3.2 多糖測定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線：依據(jù)文獻(xiàn)[11]配制0.1mg/mL母液。取0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于25mL比色管中，配制待測溶液。在490nm波長下，依據(jù)硫酸-苯酚顯色法[11-12]，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：將提取液回收溶解，濃縮原體積1/8～1/10，加無水乙醇至80%以上，靜置8～12h，3000轉(zhuǎn)/min離心15～20min，熱水溶解，以純水為溶劑定容至100mL容量瓶中，移取1mL母液于25mL比色管依據(jù)上法測定含量。

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

選擇酶添加量、超聲提取時(shí)間、pH值為試驗(yàn)因子，以總黃酮、多糖得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，各因素水平見表3。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)1.3.1方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁對(duì)照品在(0.11～0.56)mg/mL，線性關(guān)系良好。其回歸方程為Y=0.592x+0.0125,R2=0.9999。

2.1.2 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)1.3.2.方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，多糖對(duì)照品在(2.33～23.3)μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。其回歸方程為Y=0.0174x+0.0227，R2=0.9997。

2.2 正交工藝優(yōu)化

通過實(shí)驗(yàn)比較選取超聲時(shí)間，酶添加量，超聲功率pH為主要因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，選取L9(43)，每組實(shí)驗(yàn)平行3次取平均值，其結(jié)果如表2。

表2 正交分析結(jié)果

為了更好地評(píng)價(jià)工藝，將以上多糖及總黃酮收率加權(quán)，綜合考核工藝。加權(quán)方法如下：二者算數(shù)平均值比值為系數(shù)[11]，經(jīng)計(jì)算為2.13，將多糖轉(zhuǎn)換成總黃酮，即多糖收率乘以2.13加上總黃酮收率總為總指標(biāo)。公式如下：

總指標(biāo)=2.13×T(多糖)+F(黃酮)

通過R值其所選因素影響是：時(shí)間>酶濃度>功率>pH，最佳工藝條件4號(hào)A2B1C2D3，提取時(shí)間40min，酶濃度0.5%，pH=5，功率在450W，其加權(quán)收率為18.6864。依據(jù)K值可能最佳組合A1B3C3D4不在正交設(shè)計(jì)表范圍內(nèi)，所以需要進(jìn)一步驗(yàn)證，以期獲得最佳工藝。將A1B3C3D4組合依據(jù)前方法提取，獲得收率多糖為6.65%，總黃酮為2.89%，其結(jié)果低于組合A2B1C2D3，所以最佳工藝為A2B1C2D3。

2.3 放大實(shí)驗(yàn)

依據(jù)2.3，選取4號(hào)作為工藝考參數(shù)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)大10倍，每組重復(fù)3次，結(jié)果取算數(shù)平均值，驗(yàn)證工藝穩(wěn)定性。其結(jié)果如下表3。

表3 工藝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)放大10倍后，其黃酮提取率平均值為3.1716%，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.09%，多糖為7.3933%，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.21%，表明提取工藝參數(shù)較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

對(duì)東北茶藨子活性成分提取進(jìn)行了研究，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和加權(quán)分析顯示，超聲波-酶促提取法有利于茶藨子總黃酮及多糖的提取，并具有提取時(shí)間短、耗能相對(duì)較低的特點(diǎn)。其多糖得率為7.39%，總黃酮為3.17%。

總之, 本工藝二種主要指標(biāo)在放大10 倍后，工藝相對(duì)穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1%以內(nèi)。所以以上工藝具有一定應(yīng)用價(jià)值。