呂 芳 郭 文 丁 剛 劉 瑋 詹冬梅 吳海一

?

中國近海銅藻與I序列相似性分析*

呂 芳1,2郭 文1丁 剛1,2劉 瑋1,2詹冬梅1,2吳海一1,2①

(1. 山東省海洋生物研究院 青島 266104；2. 青島市大型海藻工程技術(shù)研究中心 青島 266104)

本研究分別對2016和2017年中國近海10個銅藻()漂浮地理種群以及 3個定生種群的51個采集樣本進行了和I序列分析及相似性比對。結(jié)果顯示，51個樣本的I序列完全一致，序列存在2個變異位點，按基因型的異同可分為4個類型，其中大連龍王塘、煙臺大欽島和南隍城島的漂浮銅藻基因型相同，青島金沙灘漂浮型、煙臺大欽島和大連獐子島的定生銅藻基因型相同，威海俚島和溫州洞頭的漂浮銅藻基因型相同，青島雕塑園、王哥莊、大珠山、威海乳山的漂浮型和枸杞島定生銅藻基因型相同，而同一種群內(nèi)部即便是不同年份的個體間基因型并沒有差異?；谛蛄袠?gòu)建的系統(tǒng)樹顯示，來自中國的所有銅藻樣本聚為一支，與來自韓國的銅藻樣本有一定的遺傳距離。以上結(jié)果說明，我國近海漂浮和定生銅藻的不同地理株間和I的遺傳變異水平較低，漂浮銅藻可能具有不同的來源，為進一步探明中國近海海域銅藻的分子遺傳背景提供依據(jù)。

銅藻；漂浮；定生；；I；序列相似性

銅藻(Turner) C. Agardh屬于褐藻門、墨角藻目、馬尾藻屬，大多生長在低潮帶深沼中或大干潮線下4 m處的巖石上，是中國沿海海藻場的重要組成部分(曾呈奎等, 2000)。銅藻是一種重要的經(jīng)濟海藻，對海水中的富營養(yǎng)化物質(zhì)具有較強的生物吸附能力，具有重要的生態(tài)價值；銅藻富含巖藻黃素、褐藻膠、褐藻多酚等生物活性物質(zhì)，使其在醫(yī)藥保健、生物制品以及化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域也極具開發(fā)潛力(Liu, 2012; 詹冬梅等, 2016)。2007年以來，黃海海域連年暴發(fā)大規(guī)模的滸苔綠潮，其中還夾著一些漂浮銅藻(蔡永超等, 2014; 陳軍等, 2016)，尤其是2017年綠潮災(zāi)害中漂浮銅藻的生物量顯著高于往年同期，局部海域漂浮的銅藻可達滸苔數(shù)量的20%，形成“馬尾藻金潮”(http://news.xinhuanet.com/2017-06/ 17/c_1121162366.htm)。漂浮銅藻的過量繁殖，會在水面織成一張網(wǎng)，導(dǎo)致底層養(yǎng)殖的魚蝦缺氧，使水體環(huán)境惡化，影響?zhàn)B殖環(huán)境。此外，漂浮的銅藻還會纏繞堆積在紫菜和海帶的養(yǎng)殖筏架上，對筏架養(yǎng)殖造成一定影響(http://www.js.xinhuanet.com/2017-01/11/c_ 1120284277.htm)。漂浮銅藻的出現(xiàn)進一步加大了山東半島綠潮防治的難度，也成為一種新的災(zāi)害現(xiàn)象。目前，國內(nèi)外研究主要集中在對綠潮滸苔的溯源和防控等方面(汪文俊等, 2008; 劉峰等, 2012; 王廣策等, 2016)，漂浮銅藻的來源及暴發(fā)原因到目前尚沒有明確的認識，尚需多方尋求論證。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于物種鑒定以及屬內(nèi)種間和不同地理株間的分子系統(tǒng)演化關(guān)系等研究(Lane, 2007; Kucera, 2008; Mcdevit, 2009)。盡管銅藻不同地理種群的系統(tǒng)發(fā)生研究已有一些相關(guān)報道(Hu, 2011; 蔡一凡等, 2013)，但由于不同的DNA序列進化速率不同，往往會導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異，因此，進一步選擇合適的分子標(biāo)記以及地理范圍分布更廣的不同居群進行分析，可為銅藻的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性分析等提供新的佐證。

圖1 2017年威海俚島灣養(yǎng)殖區(qū)紫菜養(yǎng)殖筏架上的銅藻(A)和青島金沙灘海岸上堆積的銅藻(B)

Fig 1onrafts of Lidao aquaculture area (A) and accumulated on the coast of Golden Beach of Qingdao (B) in 2017

本研究分別從我國東海、黃海、渤海等不同海域采集銅藻樣品，通過對其核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer)和線粒體I(細胞色素c氧化酶亞基I)序列進行擴增、測序和分析，旨在研究我國近海海域銅藻的分子遺傳背景以及不同海域漂浮銅藻和野生銅藻的相互關(guān)系，為銅藻的生物地理學(xué)研究提供新的證據(jù)，進而為漂浮銅藻的溯源、分布范圍和漂移路線的監(jiān)測等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

銅藻是一種潮下帶的大型褐藻，定生于海底巖礁上，近年來，由于海洋生態(tài)環(huán)境的改變，銅藻資源不斷衰退，因此，定生的銅藻種群已很難采集到。本研究所用定生和漂浮銅藻樣品采集自中國東海、黃海和渤海海區(qū)(表1)，其中，定生銅藻種群采集自舟山、煙臺和大連3個地區(qū)，10個漂浮銅藻種群采集自溫州、青島、威海、煙臺和大連等地區(qū)。樣品采集后用低溫箱迅速運回實驗室，藻體用海水反復(fù)沖洗，去除泥沙及雜質(zhì)，然后用消毒海水清洗干凈，保存于?20℃。

1.2 基因組DNA制備

實驗采用TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)提取銅藻樣品的基因組DNA，具體步驟參照說明書。提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，紫外分光光度計定量后，置于?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 銅藻樣品采集信息

Tab.1 Information of S. horneri samples

1.3 ITS和coxI序列的擴增

為了獲得盡可能長的序列，分別擴增2段片段，然后進行拼接。其中，5.8S rDNA-序列的擴增參考White等(1990)，引物序列為5 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3′；4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴增程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，總35個循環(huán)；72℃延伸10 min。完整2序列的擴增參考Yoshida等(2000)，引物序列為BFF 5′-CGATGAAGAACGCAGCGAAATG-CGAT- 3′；25BR2R 5′-TCCTCCGCTTAGTATATGCTTAA- 3′。擴增程序為93℃預(yù)變性1 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，總35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

I序列的擴增參考Lane等(2007)，引物序列為GazF2：5′-CCAACCAYAAAGATAT-WGGTAC-3′；GazR2：5′-GGATGACCAAARAACCAAAA-3′。擴增程序為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，38個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)體系均為25 μl，包含PCR Master mix (BBI,加拿大) 12.5 μl，上、下游引物(20 μmol/L)各1.0 μl，模板DNA 20 ng。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增成功的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司進行正反向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用DNAStar-Editseq軟件和Chromas軟件對測序結(jié)果進行分析、校正，然后將拼接成功的序列輸入到GenBank中進行BLASTn同源性分析，再用Clustal X1.83軟件對序列進行比對分析。用MEGA 6.06軟件Kimura 2-parameter模型計算不同銅藻樣品間的遺傳分化距離，構(gòu)建系統(tǒng)樹，Bootstrap方法進行1000次重抽樣估計系統(tǒng)樹中節(jié)點的置信值，以羊棲菜()作為外類群。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS區(qū)序列分析

本研究中所有樣品的序列長度均為1506 bp，包括部分1、完整的5.8S rDNA和完整的2序列，其中，1序列長度為765 bp，5.8S rDNA長度為159 bp，2序列長度為582 bp，同一種群個體間測序結(jié)果一致。對銅藻樣本單個個體的的PCR產(chǎn)物進行雙向測序結(jié)果顯示，LD和DT樣本的第1016位點正向測序結(jié)果是C，反向測序結(jié)果是T，LWT、DQD和NHC樣本的第1014位點正向測序結(jié)果是T，反向測序結(jié)果是C，這2個變異位點均位于2區(qū)，后續(xù)分析中以兼并堿基Y表示。經(jīng)ClustalX比對分析，結(jié)果顯示，51個樣本的序列僅上述2個變異位點存在差異，按基因型的異同可分為4個類型，其中，LWT、DQD和NHC的漂浮銅藻基因型為“TGTGYATTTTT”；JST漂浮型和DQD、ZZD的定生銅藻基因型為“TGTGTATTTTT”，LD和DT的漂浮銅藻基因型為“TGTGCAYTTTT”，其余幾組樣本基因型完全一致，為“TGTGCATTTTT”(表2)。GQD-DS和LD銅藻地理種群采集的是2016和 2017年的樣品，相同年份和不同年份內(nèi)部個體的基因型均沒有差異。

表2 銅藻區(qū)變異位點

Tab.2 Variable nucleotide sites of ITS sequences of S. horneri

*表示正反向測序結(jié)果不一致

* indicates inconsistent results of forward and reverse sequencing

與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)序列進行比較，發(fā)現(xiàn)與3株銅藻的相應(yīng)序列僅有幾個堿基差異，相似性在98%以上，其中，藻株(序列號為AY149998.1)于1994年采自韓國江陵市海區(qū)，藻株(序列號為JF710312.1)于2008年采自中國沿海，藻株(序列號為AY149999.1)于 1994年采自韓國仁川市海區(qū)。

將文獻中報道的浙江沿海銅藻樣本的2種基因型DT 01和HKA 01(蔡一凡等, 2013)、2013年綠潮暴發(fā)期間采自中國青島近海漂浮銅藻樣本QD2013 (陳軍等, 2016)以及NCBI數(shù)據(jù)庫采自韓國的銅藻樣本AY149998.1和AY149999.1遺傳分化距離變異范圍為0~0.0175，不同地理株間區(qū)的遺傳變異水平較低。其中，AY149999.1與QD2013的遺傳分化距離最大，為0.0175；HKA 01、DT 01與本研究的 51個樣本之間的遺傳分化距離均為0。

構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，來自中國的所有銅藻樣本聚為一支，然后再與韓國江陵市海區(qū)的AY149998.1樣本聚合，而來自韓國仁川市海區(qū)AY149999.1樣本則自為一支(圖2)。

圖2 基于銅藻ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹 (羊棲菜作為外類群)

2.2 coxI序列分析

本研究中所有樣品的I序列長度為655 bp，經(jīng)ClustalX比對分析結(jié)果顯示，所有樣品的I序列完全相同。與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)序列進行比較，發(fā)現(xiàn)與來自溫州南麂島小虎嶼(27°27′N, 121°04′E)定生銅藻樣品的相應(yīng)序列(KJ938300)完全相同，與另外2個采集地不詳?shù)你~藻(GenBank序列號為KC782896、JF718400)覆蓋區(qū)序列的相似性在99%以上。

3 討論

利用分子標(biāo)記進行銅藻不同地理種群的系統(tǒng)發(fā)生研究已有一些相關(guān)報道。Hu等(2011)基于線粒體3和葉綠體L基因序列對西北太平洋地區(qū)銅藻的生物地理分布及分布影響因子的研究中，提出在中國黃渤海、東海、南海地區(qū)的洋流及沿岸流的影響下，分布在3個海洋區(qū)系內(nèi)的銅藻形成狹窄的遺傳結(jié)構(gòu)，不具備明顯的異質(zhì)性。蔡一凡等(2013)對我國浙江沿海銅藻群體采集的樣品進行5.8S rDNA-序列分析，表明僅有1個變異位點，說明群體間沒有明顯的遺傳分化，遺傳多樣性較低。本研究發(fā)現(xiàn)，2016和2017年的中國近海10個銅藻漂浮地理種群以及3個采集地定生種的51個樣本的I序列完全一致，序列存在2個變異位點，按基因型的異同可分為4個類型，而同一地理種群相同年份和不同年份的內(nèi)部個體間均沒有差異。基于序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示，來自中國的所有銅藻聚為一支，與來自韓國的銅藻有一定的遺傳距離，說明我國近海銅藻不同地理株間和I的遺傳變異水平較低，但基因型存在一定差異，因此，漂浮銅藻可能具有不同的來源。而Su等(2018)利用多態(tài)性微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記對黃海、東海13個代表性漂浮種群和3個代表性定生種群遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，相同年份漂浮銅藻的親緣關(guān)系相近，而不同年份差異顯著；同一漂浮種群內(nèi)部也存在遺傳分化，推測不同年份漂浮銅藻起源于不同的地點，同一漂浮種群的個體也可能源自不同地點。由于上述文獻中銅藻種群的采集地點存在差異，所用的DNA分子標(biāo)記也不同，因此，研究結(jié)論的不同還需要進一步分析和解析。

銅藻在溫度為7.0℃~20.5℃時，均可以很好地生長，在10℃以下低溫期能達到最高生長率，且對光照的適應(yīng)范圍很廣(孫建璋等, 2009)，因此，銅藻對環(huán)境具有較強的適應(yīng)能力，可在中國沿海大范圍的漂浮生長。2007~2017年衛(wèi)星遙感的滸苔監(jiān)測信息和海面風(fēng)場資料分析表明，在風(fēng)場和流場作用下，銅藻和綠潮滸苔由外長江口以北的黃海中南部漂到黃海北部(Hu, 2009; 金松等, 2016)。Komatsu等(2007、2008)通過GPS定位綁有漂浮藻類的浮標(biāo)觀測發(fā)現(xiàn)，春季到初夏期間，中國東海區(qū)域位于黑潮鋒和大陸架之間的區(qū)域常有大片漂浮銅藻出現(xiàn)，進一步觀察發(fā)現(xiàn)一處浮標(biāo)可到達日本九州東側(cè)海域，另一處可到達韓國濟州島南端，這也是目前關(guān)于漂浮銅藻溯源的最直接的證據(jù)。盡管銅藻在中國沿海均有分布，但銅藻主要是浙江沿海優(yōu)勢種，其中，南麂列島和枸杞島是我國銅藻數(shù)量自然分布最集中的水域(孫建璋等, 2008a; 畢遠新等, 2014)。由于夏季東黃海盛行東南季風(fēng)，在東南季風(fēng)影響下，黃海表層海流基本上是由南向北流動，在黃海沿岸外側(cè)海域，是由東南向西北方向流動(梁兼霞等, 2005)，而表層流的流向決定海洋中漂浮海藻漂流方向。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，威海俚島和溫州洞頭的漂浮銅藻樣本具有相同的序列，青島雕塑園、王哥莊、大珠山、威海乳山的漂浮銅藻和枸杞島的定生銅藻樣本具有相同的序列，因此，推測山東沿海漂浮銅藻的源頭之一可能在南黃海，在風(fēng)浪和海流的作用下飄到黃海北部，部分在青島和威海等地的海岸堆積，部分纏繞在養(yǎng)殖筏架上常年漂浮生長。

孫建璋等(2008b)研究表明，銅藻自然種群的繁衍以有性生殖為主，殘枝營養(yǎng)繁殖藻株約占種群藻株總數(shù)的5%，但隨著海洋污染加劇和海洋環(huán)境的變化，天然銅藻海藻場的面積不斷縮小(孫建璋等, 2008a)。Su等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，2013年近岸海域人工混凝土礁區(qū)采集的漂浮銅藻與2016年該區(qū)域發(fā)現(xiàn)的定生銅藻的親緣關(guān)系較近，認為向北漂浮的銅藻能夠完成生殖過程并在漂移的路徑上形成定生的種群。2015~2017年，連續(xù)3年跟蹤監(jiān)測威海俚島海區(qū)的漂浮銅藻，發(fā)現(xiàn)其形成成熟的有性生殖器官——生殖托的藻株數(shù)量不超過種群藻株總數(shù)的5%，漂浮銅藻主要通過斷枝(Fragmentation)進行營養(yǎng)繁殖，因此，這可能是增加該藻資源量的一條有效途徑，在一定程度上可為銅藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供種藻供應(yīng)。但是，目前我們尚未在該海區(qū)發(fā)現(xiàn)定生的銅藻，因此，認為漂浮銅藻是否能形成定生種群尚待進一步的實驗論證。由于大型漂浮藻類受風(fēng)浪和海流等多種因素的影響，其時空分布和生物量可能會經(jīng)常發(fā)生變化，因此，需要密切關(guān)注它們對生態(tài)環(huán)境的影響。

致謝：本研究承蒙中國科學(xué)院海洋研究所孫忠民老師提供煙臺南隍城島和大連獐子島銅藻樣品，謹此致謝!

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Analysis of the Similarity ofandI Sequences ofAlong the Offshore of China

Lü Fang1,2, GUO Wen1, DIND Gang1,2, LIU Wei1,2, ZHAN Dongmei1,2, WU Haiyi1,2①

(1. Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266104; 2. Qingdao Macroalgae Engineering Technology Research Center, Qingdao 266104)

Large-scale green tides have broken out annually in the Yellow Sea since 2007, which, upon twinning with floating, became a new hazard and increased the difficulty of preventing and controlling the green tide in Shandong Peninsula. In this study, the similarity ofandI sequences were analyzed usingsamples collected from ten free-floating populations and three benthic populations in 2016 and 2017 along the offshore of China. The results showed that theI sequences of 51 samples were consistent, while there were two variable nucleotide sites within thesequence. Based on genotypic differences,samples could be sorted into four categories, among which the genotype of free-floating samples from Dalian Longwangtang, Daqin Island, and Nanhuangcheng Island of Yantai were identical. Free-floating samples from the Golden Beach of Qingdao and benthic samples from Daqin Island of Yantai and Zhangzi Island of Dalian were identical; free-floating samples from Lidao of Weihai and Dongtou of Wenzhou were identical; and free-floating samples from the Sculpture Garden, Wanggezhuang, Dazhushan of Qingdao, Rushan of Weihai, and benthic samples from Gouqi Island were identical. However, there was no difference in genotype among individuals within the same population, even among those occurring in different years. A phylogenetic tree based onsequences ofshowed that samples from China were clustered together; however, there was some genetic distance from the Korean samples. It is possible that the genetic variation ofandI regions is low in different coastal strains of, and that drifting population could be of different origins. These findings will provide a basis for further understanding of the molecular genetic background ofalong the offshore of China.

; Free-floating; Benthic;;I; Sequence similarity

WU Haiyi, E-mail: wuhaiyi1997@163.com

呂芳, 郭文, 丁剛, 劉瑋, 詹冬梅, 吳海一. 中國近海銅藻與I序列相似性分析. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2018, 39(6): 141–146

Lü F, Guo W, Dind G, Liu W, Zhan DM, Wu HY. Analysis of the similarity ofandI sequences ofalong the offshore of China. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 141–146

* 海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201505022)和山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目共同資助[This work was supported by the Public Science and Technology Research Fund Projects of Ocean (201505022), and Agricultural Application Technology Innovation Project of Shandong]. 呂 芳，E-mail: lvfang8254@163.com

吳海一，研究員，E-mail: wuhaiyi1997@163.com

2017-11-21,

2017-12-18

10.19663/j.issn2095-9869.20171121001

S917.3

A

2095-9869(2018)06-0141-06

(編輯 馬璀艷)