張沙沙，盧蔚波，張 婷，沙如意,2,3，毛建衛(wèi),2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

紅茶菌是一種中國(guó)民間傳統(tǒng)酸性飲料，由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌等多混合菌群發(fā)酵制得[1]。紅茶菌在發(fā)酵期間會(huì)在其表面產(chǎn)生一層白色透明質(zhì)地堅(jiān)硬的膜——細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)[2]。它本質(zhì)上是一種高結(jié)晶體的纖維素，是由一些特殊種類的細(xì)菌將D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的鏈狀高分子聚合物[3]。

細(xì)菌纖維素是一種具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的納米級(jí)多孔生物高分子聚合物[4],它在物理性質(zhì)、化學(xué)組成、生物學(xué)特性、分子結(jié)構(gòu)上等都與天然植物纖維素非常相似，但一般很難得到高純度的天然纖維素，而細(xì)菌纖維素只含有纖維素成分，不含有木質(zhì)素、半纖維素等成分，從而為得到高純度纖維素提供了良好的途徑。又因細(xì)菌纖維素具有較好的生物可降解性、極強(qiáng)的親水力、環(huán)境友好性和生物相容性等諸多優(yōu)良特性，近些年來(lái)引起國(guó)內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。細(xì)菌纖維素作為一種新型的生物材料，已經(jīng)在醫(yī)藥、環(huán)保、造紙、精紡和化工等領(lǐng)域得到應(yīng)用[5]。它作為生物基材料的基體有很重要的作用，一般是通過(guò)勻漿混合得到所制備產(chǎn)物[6]。納米細(xì)菌纖維素在食品中也有著重要的作用，除了用作食品添加劑之外，也可用作直接食用的膳食纖維，這是一種降低各類疾病的天然物質(zhì)[7]；在發(fā)酵液中添加透明質(zhì)酸等物質(zhì)，采用靜態(tài)發(fā)酵可得到具有特殊性能的細(xì)菌纖維素面膜[8]；細(xì)菌纖維素膜作為可循環(huán)、純天然的生物基材料可直接運(yùn)用在服飾設(shè)計(jì)中[9]。目前工業(yè)化生產(chǎn)細(xì)菌纖維素面臨的主要問(wèn)題，是生產(chǎn)成本過(guò)高而產(chǎn)量過(guò)低[10]。本文以紅茶菌為發(fā)酵菌種輔以葡萄糖為碳源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，分析細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)，例如，發(fā)酵過(guò)程中酸度與還原糖的變化、細(xì)菌纖維素膜的復(fù)性、細(xì)菌纖維素表征。通過(guò)研究分析細(xì)菌纖維素的微觀結(jié)構(gòu)、宏觀性能及在發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)，為細(xì)菌纖維素的發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

紅茶菌原液(我愛(ài)發(fā)酵養(yǎng)身菌)；氫氧化鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；酵母浸粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；冰醋酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；葡萄糖(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)；硫酸鎂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，以上試劑均為分析純。

1.2 儀 器

電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9140MBE(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2(國(guó)華電器有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱SPX-250B-Z(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；JEM-1011型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)；pH計(jì)PHS-3C(杭州齊威儀器有限公司)；電子天平FA2004(上海舜宇橫平科學(xué)儀器有限公司)；傅立葉變換紅外光譜儀(德國(guó)布魯克儀器公司)；超聲波清洗器KQ-500E(昆山市超聲儀器有限公司)；熱重分析儀Q500-V20.6(德國(guó)耐馳儀器制造公司)；X射線衍射儀D8 AD-VANCE型(德國(guó)國(guó)布魯克公司)；元素分析儀VARIO MICRO(瑞士大昌華嘉集團(tuán)公司)。

2 試 驗(yàn)

2.1 試驗(yàn)過(guò)程

2.1.1 紅茶菌菌種活化

取一片紅茶菌菌液中的細(xì)菌纖維素膜放入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至48 h，此時(shí)在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)液的表面會(huì)有新的細(xì)菌纖維素膜生成。種子培養(yǎng)基的配方為2 g葡萄糖、1 g酵母粉、0.1 g磷酸氫二鉀、1 g硫酸鎂、3 mL無(wú)水乙醇，溶于100 mL水中，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

2.1.2 細(xì)菌纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)

將紅茶菌種子菌接種于細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30 ℃，發(fā)酵數(shù)天得到細(xì)菌纖維素。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖5 g，酵母粉1 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鎂1 g，無(wú)水乙醇3 mL，溶于100 mL水中，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

2.1.3 細(xì)菌纖維素純化處理與檢測(cè)

將細(xì)菌纖維素膜從發(fā)酵培養(yǎng)液中取出，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% NaOH溶液中煮沸1 h后，取出細(xì)菌纖維素膜用去離子水浸泡沖洗，直至細(xì)菌纖維素膜呈現(xiàn)白色透明狀態(tài)，且細(xì)菌纖維素表面洗滌液pH呈中性并在280 nm波長(zhǎng)下無(wú)吸收為止[11]；將細(xì)菌纖維素膜置于去離子水中，冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分析和檢測(cè)

2.2.1 發(fā)酵液pH值

利用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

2.2.2 培養(yǎng)基中的還原糖含量

利用DNS法測(cè)定還原糖含量，量取適量的樣品于試管中，加入DNS試劑1.5 mL沸水浴5 min，置于冰水中冷卻，用蒸餾水補(bǔ)足反應(yīng)產(chǎn)物至10 mL，加試管塞后混合均勻，利用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm下檢測(cè)，用空白管調(diào)零點(diǎn)[12]。

2.2.3 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量測(cè)定

取不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌纖維素清洗后于烘箱中(65 ℃)烘干至恒重，稱量。

2.2.4 掃描電鏡觀察

在利用隧道掃描電子顯微鏡對(duì)待測(cè)樣品觀察拍照前，將BC膜試樣在干燥箱中進(jìn)行再次干燥，然后將干燥好的樣品剪取1 cm左右小片粘貼于導(dǎo)電膠上，并置于真空鍍膜機(jī)中進(jìn)行表面噴金1 min，噴金后的樣品放入掃描電鏡中觀察[13]并拍照，觀察電壓為5 kV。

2.2.5 熱重分析

將待測(cè)樣品在鼓風(fēng)干燥箱中充分干燥至恒重后，磨碎，稱量10 mg左右的樣品于Al2O3小坩堝中，放入熱重分析儀中在空氣氣氛下檢測(cè)。升溫速度為10 ℃/min；溫度范圍為50～900 ℃；保護(hù)氣(空氣)為150 mL/min[14]。

2.2.6 紅外光譜分析

取干燥后并粉碎的待測(cè)樣品粉末，與KBr粉末混合均勻后進(jìn)行紅外光譜測(cè)定[15]，采用傅立葉變換紅外光譜儀及衰減全反射技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析表征，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

2.2.7 元素分析

取待測(cè)樣品并研磨成粉末狀，抽真空干燥后進(jìn)行分析，計(jì)算提純前后細(xì)菌纖維素基材中各元素的含量。

2.2.8 X射線衍射分析

將待測(cè)樣品充分干燥后磨碎，取適量的粉末于樣品板上。Cu靶，40 kV高壓，管流為40 mA，2θ為0°～50°掃描，得到XRD光譜，采用jade軟件計(jì)算結(jié)晶度[16]。結(jié)晶度(CI)的計(jì)算公式如下：

(1)

式(1)中：Iam為2θ等于18°時(shí)的強(qiáng)度值；I020為晶格衍射的最高強(qiáng)度值。

3 分析與討論

3.1 細(xì)菌纖維素發(fā)酵過(guò)程中主要指標(biāo)變化

圖1 細(xì)菌纖維互發(fā)酵過(guò)程中主要檢測(cè)指標(biāo)的變化Fig.1 Change of main indicators during fermentation of BC

利用紅茶菌為菌種發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌纖維素產(chǎn)量與pH值、還原糖消耗量的變化關(guān)系如圖1所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，還原糖呈先急劇下降而后緩慢下降的趨勢(shì)，從51.16 g/L降到10.55 g/L，這說(shuō)明紅茶菌在發(fā)酵前期將大量葡萄糖用于自身菌體的生長(zhǎng)和合成代謝，在發(fā)酵后期將葡萄糖用于合成細(xì)菌纖維素。細(xì)菌纖維素先緩慢增加再急劇增加，在紅茶菌大量增殖以后才快速地合成細(xì)菌纖維素，發(fā)酵7 d得到BC 4.39 g/L。發(fā)酵液的pH值與還原糖的變化趨勢(shì)相一致，先急劇下降再緩慢降低，pH值從4.77降到3.08。其原因是以葡萄糖作為主要能源物質(zhì)時(shí)，在溶氧充足的條件下，葡萄糖作為能量物質(zhì)能夠參與磷酸戊糖路徑或經(jīng)檸檬酸循環(huán)后被氧化分解生成乙酸、葡萄糖酸、5-酮基葡萄糖酸等酸性成分[17]，從而導(dǎo)致發(fā)酵液pH值持續(xù)降低。發(fā)酵過(guò)程中pH值的降低對(duì)細(xì)菌纖維素的合成不利，一方面葡萄糖的代謝流更多地流向乙酸和葡萄糖酸的路徑。另一方面pH值的下降不利于紅茶菌的增殖，直到抑制紅茶菌的生長(zhǎng)從而降低細(xì)菌纖維素的合成速率，這點(diǎn)從細(xì)菌纖維素含量在發(fā)酵后期增加速度變緩和葡萄糖利用速度下降中可以得到驗(yàn)證。因此，在以后的發(fā)酵研究中，可以采用果糖或甘油等作為底物，以降低用葡萄糖作為碳源形成的葡萄糖酸。有研究報(bào)道以果糖為碳源合成細(xì)菌纖維素過(guò)程中，沒(méi)有有機(jī)酸的形成故可以保持pH值的恒定[18]；并且采用pH值恒定的發(fā)酵在一定程度上也可能促進(jìn)細(xì)菌纖維素的合成量。

3.2 隧道掃描電子顯微鏡結(jié)果與分析

將細(xì)菌纖維素預(yù)處理、烘干后利用掃描電鏡進(jìn)行觀察，由圖2可知，紅茶菌發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素具有超細(xì)的微孔結(jié)構(gòu)，能很明顯地發(fā)現(xiàn)細(xì)菌纖維素膜是由成條的纖維散亂地分布編織在一起，其直徑在100～500 nm之間。因此，生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素具有超細(xì)結(jié)構(gòu)，其尺寸比天然纖維素小得多。

圖2 細(xì)菌纖維素隧道掃描顯微鏡圖片F(xiàn)ig.2 Scanning tunneling microscopy pictures of BC

3.3 熱重結(jié)果與分析

圖3 細(xì)菌纖維素的熱重分析圖譜Fig.3 Thermogravimetric analysis of BC

利用熱重分析儀對(duì)得到的待測(cè)樣品進(jìn)行熱穩(wěn)定性能分析，主要對(duì)樣品進(jìn)行熱重分析(thermogravimetric analysis，TG或TGA)和微熵?zé)嶂胤治?diffrential thermal gravity, DTG)，DTG曲線是對(duì)TG曲線微分后得到的曲線，它本質(zhì)上是TG曲線對(duì)溫度或時(shí)間的一階導(dǎo)數(shù)。試驗(yàn)所得樣品的TG、DTG和示差掃描量熱法(diffrential scanning calorimetry, DSC)試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。根據(jù)TG曲線可以明顯看出樣品在240 ℃前質(zhì)量損失較小，主要是失去物理吸附的自由水以及氫鍵結(jié)合水；在240～325 ℃有較大的失重，最快分解溫度在296 ℃和307 ℃處，主要是由于樣品的—OH脫水造成的，質(zhì)量減少了46%；325～607 ℃也有較大的失重，主要原因是樣品中碳鏈熱分解，并且是在此過(guò)程中生成副產(chǎn)物揮發(fā)造成的，最快分解溫度為505 ℃；在607 ℃后TG曲線進(jìn)入平穩(wěn)期，最后殘余灰分約11%，有可能是預(yù)處理過(guò)程中清洗得不夠徹底干凈所致。本研究所得細(xì)菌纖維素的最大失重速率溫度為296 ℃。

3.4 紅外光譜結(jié)果與分析

圖4 細(xì)菌纖維素的紅外分析圖譜Fig.4 Infrared spectrum analysis of BC

由圖4可知，所得產(chǎn)物的紅外光譜中含有幾個(gè)非常明顯的吸收峰，在3 400.4 cm-1附近處的強(qiáng)吸收峰為分子間氫鍵引起的O—H基的伸縮振動(dòng)，這說(shuō)明細(xì)菌纖維素中含有大量的羥基；在2 920.1 cm-1的吸收峰為C—H鍵的伸縮振動(dòng)，在1 643 cm-1附近是因?yàn)槔w維素末端半羧醛基所引起的伸縮振動(dòng)，在1 064 cm-1附近為C—O—C鍵和C—O—H鍵的伸縮振動(dòng)。綜合上述光譜信息可知，所得產(chǎn)物具有O—H基、C—H鍵、C—O鍵，是纖維素的特征峰。

3.5 元素組成與分析

通過(guò)表1可知紅茶菌發(fā)酵生產(chǎn)所得的產(chǎn)物在元素組成方面的信息，其產(chǎn)物主要是由C、H、O這3種元素構(gòu)成。它們占總質(zhì)量的97%以上，且C、H、O元素基本上符合分子式(C6H10O5)n，這表明合成產(chǎn)物中C、H、O元素的含量符合纖維素中各元素含量。

表1 細(xì)菌纖維素的元素分析結(jié)果Table 1 Elemental analysis results of BC

3.6 X射線晶體衍射結(jié)果與分析

圖5 細(xì)菌纖維素的XRD圖譜分析Fig.5 XRD pattern analysis of BC

4 結(jié) 論

以紅茶菌為菌種，利用葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的主要指標(biāo)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在紅茶菌發(fā)酵過(guò)程中，pH值由4.77降到3.08，還原糖含量從51.16 g/L降到10.55 g/L，發(fā)酵7 d后得到細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為4.39 g/L。結(jié)合紅外光譜分析、XRD晶體衍射、電鏡掃描、熱重分析、元素分析等方法檢測(cè)所制備的細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)和性能，可知：細(xì)菌纖維素的直徑在100～500 nm之間，其含水量在96%～99%，復(fù)水率在55%～65%,細(xì)菌纖維素膜結(jié)合了一部分自由水在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，并且纖維素含有大量的—OH與水形成氫鍵，這兩點(diǎn)是導(dǎo)致細(xì)菌纖維素膜含水量和復(fù)水率高的原因；在296 ℃處具有最大失重，失重率達(dá)46%；細(xì)菌纖維素主要由C、H、O 3種元素構(gòu)成，符合纖維素中各元素含量；紅外光譜揭示了細(xì)菌纖維素的特征吸收峰；XRD結(jié)果表明細(xì)菌纖維素的結(jié)晶度為80.21%。本研究為紅茶菌發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。