毛菊紅，金堅，王曉霞

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制備液相色譜法快速分離制備硫酸依替米星雜質G

毛菊紅1，金堅1，王曉霞2

（1.江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122；2.無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司，江蘇 無錫 214028）

為快速獲得硫酸依替米星雜質G樣品，使用制備液相色譜分離制備硫酸依替米星雜質G。具體方法為，將硫酸依替米星樣品用水溶解上樣于大孔樹脂柱，再使用硅膠柱粗分處理后，用制備液相色譜法快速制備分離；制備色譜柱為XBridgeTMPrep C185μm OBDTM（19 mm×100 mm，Column)，流動相A為水-氨水-冰醋酸（96∶3.6∶0.4，∶∶），流動相B為甲醇，梯度洗脫，快速制備雜質G樣品。采用高效液相-離子色譜、核磁共振（NMR）、電噴霧電離質譜（ESI-MS）對制備后的雜質G樣品進行結構確證。樣品經(jīng)大孔樹脂柱、硅膠柱粗分，再利用制備液相色譜從硫酸依替米星原料藥中成功分離制備雜質G樣品，純度為96.02%，經(jīng)結構確證為6″-羥基依替米星，為合成的副產(chǎn)物。建立制備液相快速分離硫酸依替米星雜質G的方法，為將來開展雜質G研究提供了參考。

硫酸依替米星；結構鑒定；制備液相；雜質G

硫酸依替米星( Etimicin sulfate) 是我國科技人員研究開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權的一類新藥，具有良好的抗感染治療效果，具有抗菌活性強，抗菌譜廣，耐受性好的特點[1]。硫酸依替米星屬氨基糖苷類抗生素，不良反應主要為耳毒性、腎毒性等，但發(fā)生率大都在1%以下，低于阿米卡星、妥布霉素和頭孢呋辛等其他同類產(chǎn)品[2]。硫酸依替米星現(xiàn)收載于《中國藥典》2015年版二部[3]，特定雜質結構如圖1所示。硫酸依替米星特定雜質結構如表1所示。

圖1 特定雜質結構

表1 硫酸依替米星特定雜質結構表

雜質編號名稱A環(huán)B環(huán)C環(huán) R1R2R3R4R5 依替米星NH2HNH2HC2H5+ A1-N-乙基-加洛糖胺脫去A環(huán)HC2H5+ B1，3-N-二乙基-加洛糖胺脫去A環(huán)C2H5C2H5+ C NH2HNH2HC2H5脫去C環(huán) D西索米星*NH2HNH2HH+ E慶大霉素C1aNH2HNH2HH+ F小諾霉素 CH3NHHNH2HH+ G OHHNH2HC2H5+ H奈替米星*NH2HNH2HC2H5+ I1-N-乙基小諾霉素CH3NH HNH2HC2H5+ J6’-N-乙基慶大霉素 C1aC2H5NHHNH2HH+ K3-N-乙基依替米星NH2HNH2C2H5C2H5+ L中間體P1CH3CONH HCH3CONHCH3COH+

表1中，*表示4′，5′之間為雙鍵；雜質D（西索米星）、雜質E（慶大霉素C1a）、雜質F（小諾霉素）、雜質H（奈替米星）有市售外，其余雜質均暫無市售。

本研究建立了制備液相色譜法制備硫酸依替米星中雜質G（依替米星有關物質）的方法，制備獲得純度95%以上的雜質G樣品，用于硫酸依替米星質量研究并輔助指導工藝研究。

1 材料

1.1 儀器

本研究所用儀器主要有2545制備液相色譜儀（美國Waters）、2424蒸發(fā)光檢測器（美國Waters）、ICS-5000離子色譜儀（美國賽默飛世爾）、積分脈沖安培電化學檢測器（美國賽默飛世爾）、MILLI-Q去離子水發(fā)生器（美國密理博公司）、AVANCE 600核磁共振譜儀（德國Bruker）、1100 LC/MSD Trap液質聯(lián)用儀（美國Agilent）。

1.2 試藥與樣品

試藥與樣品為：硫酸依替米星（批號160902-Y，無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司），層析1號樹脂（上海華震科技股份有限公司），100-200硅膠（青島海洋），HPLC級甲醇（默克，批號為I0910907738，純度≥99.9%），HPLC級冰醋酸（TEDIA，批號為16090277，純度≥99.7%），乙醇、氨水均為分析純。

2 方法與結果

2.1 制備液相色譜條件

色譜柱：XBridgeTMPrep C185μm OBDTM（19 mm×100 mm，Column)。流動相：A相，水-氨水-冰醋酸（96∶3.6∶0.4，∶∶）；B相，甲醇，梯度洗脫。流速：20 mL/min。柱溫：40～50 ℃。進樣量：1 mL。ELSD參數(shù)：載氣壓力0.3～0.4 MPa。Gain：10.流動相梯度如表2所示。

表2 流動相梯度

時間/min 流動相A/(%) 流動相B/(%) 08020 57525 127525 204060 251090 301090

2.2 離子色譜檢測條件

本研究檢測方法采用《中國藥典》2015年版二部硫酸依替米星標準含量測定第一法[3]，積分脈沖安倍檢測器（PAD)較蒸發(fā)光檢測器（ELSD）靈敏度更高[4]，更適合對氨基糖苷類抗生素組分/雜質控制進行測定。色譜柱：月旭（Welch ultimatelp）-C18十八烷基硅烷鍵合硅膠填充柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.2 mol/L三氟乙酸（含0.05%的五氟丙酸，1.5 g/L的無水硫酸鈉，0.8%（V/V）的50%氫氧化鈉溶液，用50%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3.5）-乙腈（96∶4）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測器：積分脈沖安培電化學檢測器；檢測電極：金電極（直徑為3 mm）；參比電極：Ag/AgCl復合電極；柱后加堿（50%氫氧化鈉溶液1→25，流速為0.5 mL/min）；檢測波形：四電位波型。檢測電位設定如表3所示。

2.3 雜質制備

2.3.1 雜質初步分離

取硫酸依替米星用水稀釋后先上樣于大孔樹脂柱，用不同濃度乙醇洗脫。收集洗脫液，再經(jīng)硅膠柱分離，作為供試品。將供試品濃縮去除溶劑后，用適量超純水稀釋，備用。

2.3.2 進一步制備分離

將初步分離后的雜質樣品在制備液相上進樣1 mL，按制備液相色譜條件制備。觀察圖譜，有峰出現(xiàn)后，開始收集樣品至出峰結束，按出峰順序分別標注樣1、樣2、樣3、樣4、樣5，如圖2所示。

將收集的樣品按離子色譜條件檢測，采用面積歸一法，計算雜質純度。如果收集樣品檢測純度小于95%，則將制備后的收集樣品再繼續(xù)制備，直至純度大于95%.

表3 檢測電位

時間/s電位/V積分 0.00+0.10 0.20+0.10開始 0.40+0.10結束 0.41﹣0.20 0.42﹣0.20 0.43+0.60 0.44﹣0.10 0.50﹣0.10

圖2 制備液相第一次制備

硫酸依替米星HPLC-PED檢測出峰時間為26 min，雜質G相對于硫酸依替米星的相對保留時間為1.12，因此雜質G出峰時間約為29.12 min（26 min×1.12）。

將樣1、樣2、樣3、樣4、樣5分別經(jīng)離子色譜法檢測，根據(jù)出峰時間可判定為樣3中含有雜質G，出峰時間為29.184 min，如圖3所示；純度為21.88%，如表4所示。

圖3 雜質G檢測圖譜

將樣3繼續(xù)按制備液相色譜條件制備，按離子色譜條件檢測樣品純度。第五次制備圖譜如圖4所示，樣5-2為雜質G（出峰時間為29.155 min），檢測圖譜如圖5所示，樣品純度為96.02%，檢測數(shù)據(jù)如表5所示。表5中參考值為慶大霉素C1a的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)。

表4 雜質G純度

出峰序號保留時間/min面積/nC·min峰高/nC相對面積/（%）相對峰高/（%） 17.200401.7983 144.1649.9229.32 27.76710.12957.0460.250.53 38.159304.4941 306.0087.5212.18 48.54247.314265.3731.172.47 59.15017.93580.5190.440.75 610.059138.367650.9993.426.07 710.609243.971663.0446.026.18 811.19280.156307.9941.982.87 911.53450.417175.6391.241.64 1012.40940.00489.3690.990.83 1112.7176.51727.3740.160.26 1213.35016.44753.7250.410.50 1313.6928.21134.1800.200.32 1414.0008.11827.8900.200.26 1514.57513.61034.5400.340.32 1615.35021.13256.9070.520.53 1715.85964.132168.6331.581.57 1816.3504.15918.9480.100.18 1917.417102.191243.9452.522.28 2018.27517.69838.6860.440.36 2118.7177.96421.8490.200.20 2219.90911.57933.0760.290.31 2320.7009.91023.2500.240.22 2421.65922.37851.7190.550.48 2522.975701.5041 594.98117.3214.87 2624.45924.36933.2150.600.31 2725.59232.55273.4990.800.69 2826.3593.0609.5740.080.09 2929.184886.1681 100.02321.8810.26 3029.85940.88567.1981.010.63 3131.0752.0774.6940.050.04 3232.0922.9814.2170.070.04 3333.4841.6323.1930.040.03 3435.10014.50817.2360.360.16 3536.63482.35654.6962.030.51 3639.6505.5256.5590.140.06 3741.8171.1202.0760.030.02 3843.9671.2981.8600.030.02 3946.2096.1315.2100.150.05 4050.734581.242157.77414.351.47 4159.7755.5955.2750.140.05 4264.9428.3176.4330.210.06 總計： 4 049.95110 722.592100.00100.00

圖4 制備液相第五次制備

圖5 雜質G（第五次制備）檢測圖譜

表5 雜質G（第五次制備）純度

出峰序號保留時間/min面積/nC·min峰高/nC相對面積/（%）相對峰高/（%） 16.5500.1410.3360.010.00 26.9171.7353.5920.100.01 38.9341.0952.7060.060.01 49.1596.75111.6840.400.03 510.30032.44255.9931.910.16 613.7343.8644.7350.230.01 714.6590.8000.8930.050.00 815.2847.0056.8360.410.02 918.12513.8159.7040.810.03 1029.1551 630.031252.61096.020.72 Total 1 697.678349.089100.001.00

3 結構確證

3.1 核磁共振譜儀測定

將已制備的5-2樣品（純度為96.02%），經(jīng)核磁共振譜儀測定，測試結果如表6所示。氫譜的低場區(qū)域出現(xiàn)化學位移分別為4.98 Hz/MHz和5.15 Hz/MHz的雙重峰，可能為糖的端基氫，提示該化合物中含有2個糖。化學位移在 2.54 Hz/MHz處有一個3個氫的單峰，可能為氨基上的取代甲基。低場區(qū)域在1.22 Hz/MHz處有一個3個氫的單峰，表明存在一個連在季碳上的甲基。在1.08 Hz/MHz處有一個3個氫的三重峰，表明存在乙基。

氫譜數(shù)據(jù)與慶大霉素C1a的文獻值[5]比較，發(fā)現(xiàn)A環(huán)6″位上的氫向低場位移到3.63 Hz/MHz和3.53 Hz/MHz，提示A環(huán)6″位上的氨基有可能被羥基取代。

與文獻中慶大霉素C1a的碳譜數(shù)據(jù)進行比較，發(fā)現(xiàn)多出兩個碳信號，化學位移為42.52 Hz/MHz和15.74 Hz/MHz，可能為連在氨基上的乙基。此外，B環(huán)1位碳信號向低場位移6 Hz/MHz，2位和6位碳信號分別向高場位移3 Hz/MHz和1 Hz/MHz，說明乙基取代在1位氨基上。A環(huán)6″碳向低場位移到66.3 Hz/MHz，結合氫譜數(shù)據(jù)，說明B環(huán)6″上的氨基被羥基所取代，其余數(shù)據(jù)與文獻值基本一致。進一步分析該化合物的偶合常數(shù)，A環(huán)2″位氫的偶合常數(shù)為11.7 Hz和4.0 Hz，說明2″位氫在豎鍵上，A環(huán)端基氫的偶合常數(shù)為3.4 Hz，說明端基氫在橫鍵上。A環(huán)4″位豎鍵氫為dq峰，其偶合常數(shù)為3.6 Hz和12.1 Hz，可推知5″位氫在豎鍵。C環(huán)3′位氫的偶合常數(shù)為10.7 Hz，因此2′和3′位的氫都在豎鍵，1′和2′位的偶合常數(shù)為4.0 Hz，因此1′位氫在橫鍵。B環(huán)上4，5，6位氫的偶合常數(shù)都為9.2 Hz，說明1，3，4，5，6位的氫都在豎鍵上，與慶大霉素C1a的相對構型一致。

H-H COSY譜分析得到的自旋偶合體系信息與所推斷的結構一致，相關信號如圖6所示。在HMBC譜中，可觀察到乙基上的氫與B環(huán)1位碳有相關，說明乙基取代在1位氨基上。A環(huán)的端基氫與B環(huán)4位碳有相關，說明A環(huán)通過糖苷鍵連接在B環(huán)的4位。C環(huán)的端基氫與B環(huán)6位碳有相關，說明C環(huán)通過糖苷鍵連接在B環(huán)的6位。A環(huán)羥甲基上的氫與A環(huán)4″，5″位碳相關，說明羥甲基連接在5″位。化學位移為1.22 Hz/MHz的甲基氫與C環(huán)3′，4′，5′碳相關，表明該甲基連接在4′位。連接在氨基上的甲基氫（δ2.54 Hz/MHz）與C環(huán)3′位碳有相關，表明甲氨基連接在C環(huán)3′位。主要HMBC相關如圖7所示。

ROESY譜得到的相對構型與分析氫譜偶合常數(shù)得到的結果一致，主要ROESY相關如圖8所示。鑒定雜質G的相對構型如圖9所示。

表6 樣品的H-NMR，C-NMR數(shù)據(jù)

序號1H-NMR（300MHz，D2O）13C-NMR（75 MHz，D2O） 實測值文獻值[5]實測值文獻值[5] 12.75～2.82（1H，m）2.79～2.95（1H，m）59.2651.7 22.18（1H，dt，13.0，3.6 Hz，H-e）1.09（1H，q，13.0Hz，H-a）1.96（1H，dt，12.9，4.0Hz）1.17-1.30（1H，m）34.4536.7 32.79～2.87（1H，m）2.79-2.95（1H，m）51.7250.6 43.33（1H，t，9.2Hz）3.31（1H，t，9.4Hz）89.4588.3 53.63（1H，t，9.2Hz）3.59（1H，t，9.4Hz）76.7975.4 63.34（1H，t，9.2Hz）3.25（1H，t，9.4Hz）87.8287.8 72.49（1H，dq，11.2，7.2 Hz）2.75（1H，dq，11.2，7.2 Hz） 42.52 81.08（3H，t，7.1Hz） 15.74 1′4.98（1H，d，4.0Hz）5.08 （1H，d，4.0Hz）103.39101.3 2′3.82（1H，dd，10.7，4.0 Hz）3.80（1H，dd，10.6，4.0 Hz）71.5670.2 3′2.59（1H，d，10.7Hz）2.57（1H，d，10.6Hz）65.6064.4 4′ 74.5773.3 5′4.02（1H，d，12.7Hz， H-a）3.33（1H，d，12.7Hz， H-e）4.04 （1H，d，12.4 Hz）3.31 （1H，d，12.4 Hz）70.1368.7 6′1.22（3H，s）1.20（3H，s）23.8323.0 7′2.54（1H，s）2.50（3H，s）38.9938.0 1″5.15（1H，d，3.4Hz）5.14（1H，d，3.5Hz）103.25102.2 2″2.90（1H，dt，11.7，4.0 Hz）2.81（1H，dd，3.5，7.8 Hz）52.0351.0 3″1.66（1H，dq，3.6，12.5 Hz，H-a）1.75～1.82（1H，m，H-e）1.55-1.83（2H，m）27.9727.1 4″1.45（1H，dq，3.6，12.1 Hz，H-a）1.67～1.72（1H，m， H-e）1.40-1.68（2H，m）28.0728.5 5″3.96～4.00（1H，m）3.83-3.94（1H，m）72.3171.5 6″3.63（1H，dd，12.0，3.8 Hz）3.53（1H，dd，12.0，6.8 Hz）2.57（2H，dd，10.7，6.6 Hz）66.3446.1

圖6 雜質G的H-H COSY相關示意圖

圖7 雜質G的主要HMBC相關示意圖

圖8 雜質G的主要ROESY相關示意圖

圖9 雜質G的結構式

3.2 質譜解析（ESI-MS）

ESI-MSn測定數(shù)據(jù)及解析結果：①ESI-MS m/e 479.3 [M+H]+；②ESI-MS2 m/e（479.3）分別為350，344，320， 215，191，160.離子源為電噴霧質譜，正離子模式主要給出樣品的分子離子加氫峰。正離子模式給出的二級質譜的裂解途徑如圖10所示。以上ESI-MS2信息，證明樣品與推斷結構相符。

4 結論

經(jīng)制備液相色譜制備、離子色譜檢測，可初步判定分離所得的樣品為雜質G，純度96.21%.綜合NMR和ESI-MS解析，進一步確定該樣品為依替米星有關物質6″-羥基依替米星，為依替米星類似物合成的副產(chǎn)物。

本研究僅為高純度雜質G的制備獲取，也為將來開展雜質G研究提供高純度樣品。

5 討論

藥品在臨床使用中產(chǎn)生的不良反應除了與藥品本身的藥理活性有關外，有時與藥品中存在的雜質也有很大關系，因此雜質的研究也是藥品研發(fā)的一項重要內(nèi)容。且按藥品標準物質原料申報備案辦法，作為有關物質檢查用純度需達到95%以上。

硫酸依替米星為半合成氨基糖苷類抗生素，合成工藝的參數(shù)變化甚至起始物料的變化，都將導致成品中雜質的變化，總體來說雜質來源復雜。袁耀佐、張玫等建立了高效液相色譜-電噴霧-離子阱質譜法推定硫酸依替米星中有關物質的結構，通過該方法檢出了18種有關物質，對其中13種物質的結構進行了推定[6]；李正義、晏培培等通過在色譜柱與檢測器之間連接1 個分流裝置，按照5∶1 分流比使少量流出液進入檢測器，其余流出液被收集合并。按此方法制備出4種高純度的雜質，分別為1-N-乙基-加洛糖胺、1-N-乙基-3′，4′-二-脫氧新霉胺、1-N-乙基-3″-N-脫甲基慶大霉素C1a、1-N-乙基小諾霉素[7]，該方法雖成功分離并鑒定了雜質，但分離的4個雜質純度未有數(shù)據(jù)。據(jù)現(xiàn)有技術檢索，暫未有高純度硫酸依替米星雜質G的分離純化或制備報道。

圖10 雜質G的質譜裂解途徑

制備液相色譜利用混合物中各組分物理化學性質的差異，使它們以不同程度分布在兩個不相溶的相中，從而達到分離目的[8]。本研究使用制備液相分離制備技術從硫酸依替米星原料中分離制備了雜質G依替米星有關物質6″-羥基依替米星，首次將制備液相分離純化技術應用于硫酸依替米星雜質制備純化，獲得純度96.21%的雜質G樣品，可用于硫酸依替米星質量標準研究或進一步開展雜質研究。

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2095－6835（2018）23－0047－06

C829.2

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2018.23.047

毛菊紅（1984—），女，江蘇蘇州人，在職研究生，助理工程師，研究方向為制藥工程。

〔編輯：嚴麗琴〕