張 瑩，文紹敦，童 麗，李永平

(青海大學，青海西寧810001)

已有證據(jù)表明，性激素分泌紊亂與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)在多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)的發(fā)展進程中占有重要地位。其中，IR是PCOS重要的臨床特征，約50%～70%的PCOS患者存在不同程度的IR［1］。其機制可能與胰島素受體后信號傳導障礙有關，尤其是磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphoinositide3－kinase，PI3K)介導的胰島素信號通路(PI3K/Akt)［2］。中醫(yī)認為，PCOS屬腎、肝、脾三臟功能失調，從而引起腎－天癸－沖任－胞宮軸的異常。本研究應用針刺改善生殖功能障礙聯(lián)合五子衍宗丸補腎治療，觀察對PCOS－IR模型大鼠生殖內分泌及PI3K/Akt信號通路的影響，探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康清潔級21日齡Wistar雌鼠32只，體質量(55±5)g，由甘肅獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供［許可證號:SYXK(甘)2014－0002］，適應性飼養(yǎng)2天。隨機分為空白對照組、模型組、二甲雙胍組和針藥聯(lián)合組，每組8只。

1.2 實驗藥品、試劑和儀器

主要藥品和試劑:脫氫表雄酮(DHEA，上海源葉生物科技有限公司)，注射用油(北亞試劑，國藥準字H21024303)，二甲雙胍(上海施貴寶，國藥準字H20023370)，五子衍宗丸(北京同仁堂，國藥準字Z11020188)?？崭挂葝u素(FINS)ELISA試劑盒、卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒、雌二醇(E2)ELISA試劑盒、睪酮(T)ELISA試劑盒(北京博奧拓達科技有限公司)。反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(Takara)。引物(Qiagen)。

主要儀器:血糖儀(強生穩(wěn)擇易)，低溫離心機(5424R，艾本德)，酶標儀(RT－6500，雷杜)，實時熒光定量PCR儀(LightCycler 96)。

1.3 模型制備方法［3］

根據(jù)Lee MT等的方法，除空白對照組外，其余大鼠項背部皮下注射 DHEA(6mg/100g體重，溶于0.2mL注射用油中)，連續(xù)注射20天，空白對照組同期項背部皮下注射注射用油(0.2mL)。注射第10天開始，取陰道涂片連續(xù)觀察兩個動情周期，以連續(xù)出現(xiàn)角化細胞判定為PCOS造模成功。將造模成功的PCOS大鼠于當晚8時禁食，次晨8時眶靜脈取血做空腹血糖(FPG)和 FINS檢測。計算HOMA－IR，HOMA－IR=FPG(mmol/L)× FINS(mU/L)/22.5。實驗中將HOMA－IR＞2.8的PCOS大鼠作為成功模型。

1.4 各組處理方法

除空白對照組外，其余各組大鼠為防止自身恢復排卵，在治療的同時每日于皮下注射溶于注射用油的DHEA(劑量同上)。二甲雙胍組給予二甲雙胍溶液(0.012g/mL)灌胃;針藥聯(lián)合組首先針刺治療，根據(jù)中國針灸學會分會制定的“動物針灸穴位圖譜”選用雙側“腎俞”“胰俞”“關元”“子宮”“三陰交”“豐隆”穴，直刺3～5 mm，提插捻轉強刺激并留針5分鐘后出針;然后給予五子衍宗丸溶液(0.14g/mL)灌胃，連續(xù) 28 天。

1.5 標本采集和儲存方法

末次治療當晚禁食(水)12小時，次晨8時尾靜脈采血測FPG，然后以10%水合氯醛(0.35mL/100g)行腹腔注射麻醉，于腹主動脈采血離心(3000r/min)15分鐘，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆?分離兩側卵巢，一側卵巢置于4%多聚甲醛中固定，另一側卵巢以液氮速凍，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 卵巢形態(tài)學的檢查

各組大鼠取一側卵巢，予4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(5μm)，常規(guī)脫蠟、染色、脫水、透明、封片，置顯微鏡下觀察。

1.6.2 性激素及胰島素抵抗指數(shù)的測定

血清標本采集后，采用ELISA法測定FINS、FSH、LH、E2和T，并計算HOMA－IR。嚴格按照試劑盒說明書操作。標準品孔加50μL不同濃度的標準品，樣本孔加待測樣本40μL，再加10μL樣本稀釋液，除空白孔外每孔加入酶標試劑100μL，封板溫育(37℃)1小時;稀釋洗滌液，每孔加滿洗滌液，靜置1分鐘后棄去拍干，反復5次;每孔加底物A和B各50μL，避光溫育(37℃)15分鐘，加終止液50μL，在450 nm波長處測定各孔吸光度，計算樣本濃度。

1.6.3 卵巢組織 IRS－1、PI3K mRNA 的表達測定

采用實時熒光定量PCR技術檢測卵巢組織IRS－1、PI3K mRNA的表達。標本在液氮中研磨，用Trizol法提取組織RNA，反轉錄成cDNA，以LightCycler96系統(tǒng)行實時熒光定量，引物序列見表1，反應體系如下:SYBR Green mix 10.0 μL，引物 0.8 μL，cDNA 模板 2.0 μL，水 7.2 μL。擴增反應程序:95℃，5 s;60℃，30 s，40個循環(huán)。將待測基因與內參β－actin的比值作為待測基因mRNA的相對表達量，結果采用 2－ΔΔCt計算。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequences for Real－time PCR

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)采用珋x±s表示，組間采用單因素方差分析，多重兩兩比較方差齊時采用 LSD－t檢驗，方差不齊時采用Tamhane's T2檢驗。檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠卵巢病理切片圖(圖1)

圖1顯示，空白對照組大鼠卵巢可見不同發(fā)育階段的卵泡;模型組卵巢呈多囊樣改變，閉鎖卵泡增多，直徑較大，且未見黃體分布;二甲雙胍組和針藥聯(lián)合組可見不同發(fā)育階段的卵泡及少數(shù)黃體。

圖1 各組大鼠卵巢HE染色病理圖(HE×10)Figure 1 Pathological status of the ovary in each group(HE×10)

2.2 各組間性激素水平(表2)

表2顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清FSH和E2水平明顯降低(P＜0.01)，LH和T水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組和針藥聯(lián)合組血清FSH和E2水平升高(P＜0.01)，LH和T水平降低(P＜0.01)。各治療組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠性激素水平比較表(±s)Table 2 Comparison of sex kind of hormones in each group(±s)

表2 各組大鼠性激素水平比較表(±s)Table 2 Comparison of sex kind of hormones in each group(±s)

*:與空白對照組比較，P＜0.01;#:與模型組比較，P＜0.01.

組別 n FSH(IU/L)LH(mIU/mL)E2T(pmol/L)(pg/mL)空白對照組 8 3.61±1.18 11.22±4.50 24.62±4.19 17.44±2.87模型組 8 1.08±0.44* 18.24±4.85* 6.02±1.17* 95.55±17.05*二甲雙胍組 8 2.88±0.44# 12.47±2.12# 19.66±2.60# 18.07±2.34#針藥聯(lián)合組 8 3.38±0.41# 11.24±2.72# 24.19±3.60# 20.28±1.52#F 21.756 6.465 62.594 154.543 P 0.000 0.002 0.000 0.000

2.3 各組間胰島素抵抗指數(shù)(表3)

表3顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠FINS水平及 HOMA－IR 值明顯升高(P＜0.01)，F(xiàn)PG值稍高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組和針藥聯(lián)合組FPG降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，F(xiàn)INS水平及 HOMA－IR 值降低(P＜0.01)，各治療組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠胰島素抵抗情況比較表(±s)Table 3 Comparison of insulin resistance status in each group(±s)

表3 各組大鼠胰島素抵抗情況比較表(±s)Table 3 Comparison of insulin resistance status in each group(±s)

*:與空白對照組比較，P＜0.01;#:與模型組比較，P＜0.01.

組別 n FPG(mmol/L)FINS(mU/L) HOMA－IR空白對照組 8 4.20±0.76 16.24±3.55 3.03±0.77模型組 8 4.85±0.26 48.19±8.26* 10.41±2.06*二甲雙胍組 8 4.34±0.92 22.39±4.30# 4.44±1.83#針藥聯(lián)合組 8 4.09±0.51 17.71±6.02# 3.29±1.43#F 2.077 52.668 37.608 P 0.126 0.000 0.000

2.4 各組大鼠卵巢組織IRS－1、PI3K mRNA表達水平(表4)

表4顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠卵巢組織中IRS－1、PI3K mRNA下降，說明胰島素信號通路受到抑制。與模型組比較，二甲雙胍組和針藥聯(lián)合組 IRS－1、PI3K mRNA 顯著上調(P＜0.01)。各治療組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表4 各組大鼠卵巢組織IRS－1、PI3K mRNA表達情況(±s)Table 4 The expression of IRS－1 and PI3K mRNA in ovarian tissue in each group( ±s)

表4 各組大鼠卵巢組織IRS－1、PI3K mRNA表達情況(±s)Table 4 The expression of IRS－1 and PI3K mRNA in ovarian tissue in each group( ±s)

#:與模型組比較，P＜0.01.

組別 n IRS－1 mRNA PI3K mRNA空白對照組 8 1.06±0.33 1.04±0.35模型組 8 0.75±0.39 0.82±0.25二甲雙胍組 8 3.10±0.75# 1.97±0.58#針藥聯(lián)合組 8 3.47±1.41# 1.70±0.48#F 22.133 12.402 P 0.000 0.000

3 討論

IR是PCOS的重要臨床特征，過量的胰島素通過神經－內分泌－免疫網絡的下丘腦－垂體－卵巢軸在垂體水平促進LH的分泌，使雄激素的合成和分泌增加，結果將直接導致胰島素和雄激素同時作用于肝臟抑制性激素結合球蛋白的分泌，導致血清T和E2水平增高［4］。但本實驗E2水平降低，可能原因是DHEA為外源性雄激素，注射入體內使雄激素升高，但難以區(qū)分內源性和外源性，影響其轉換為雌激素，故E2水平降低［5］。雌激素又同時對FSH分泌呈負反饋作用，使FSH水平相對降低，從而形成雄激素過多、持續(xù)無排卵，最終導致卵巢多囊樣改變［6－7］。研究表明雄激素能抑制 PI3K/Akt信號通路的傳導，從而引起IR［8］。綜上所述，雄激素作為中間環(huán)節(jié)，可使生殖內分泌發(fā)生變化及PI3K/Akt通路被抑制，本實驗采用DHEA項背部皮下注射的方法誘導PCOS－IR模型大鼠，模擬雄激素過多及排卵障礙的病癥。

從傳統(tǒng)醫(yī)學的角度，PCOS當屬腎、肝、脾功能失調，痰濕、瘀血等病理因素相互錯雜，且虛實夾雜的病癥［9－11］。腎－天癸－沖任－胞宮中醫(yī)生殖軸的異常致本病的發(fā)生。因此，本研究針灸治療選擇補腎益精，疏通任脈之氣為主，穴位選擇根據(jù)腎－天癸－沖任－胞宮軸，選用腎俞穴以補腎益精，關元穴調理沖任，局部選穴選擇治療婦科疾病經驗要穴(子宮穴);根據(jù)PCOS病因病機選取腎肝脾三經交會穴三陰交調理三臟，豐隆穴祛濕化痰，最后選用胰腧穴針對胰島素抵抗。五子衍宗丸作為古今“種子第一方”則主要以補腎為主，方中菟絲子、枸杞子為君藥補腎益精，滋補肝脾;覆盆子、五味子為臣藥補腎養(yǎng)肝，澀精止遺;車前子為佐藥利水祛痰，五藥共奏具有補腎益精的作用［12］。近年來，五子衍宗丸多用于男性生殖系統(tǒng)疾病。但有研究表明，在治療女性生殖系統(tǒng)疾病方面該藥具有類性激素作用，因而可以調節(jié)女性更年期癥狀，治療女性不孕等［13］。實驗結果顯示針藥聯(lián)合治療后，大鼠血清性激素FSH和E2水平明顯升高，LH和T水平明顯下降，F(xiàn)INS水平及HOMA－IR 值明顯下降，IRS－1、PI3K mRNA 水平顯著上調，且與二甲雙胍組差異無統(tǒng)計學意義，說明針刺聯(lián)合五子衍宗丸可以更好改善生殖內分泌水平及IR情況。

綜上所述，針藥聯(lián)合治療PCOS－IR模型大鼠療效顯著，其機制可能是通過改善下丘腦垂體卵巢軸以恢復排卵，通過上調PI3K/Akt信號通路以改善IR。但是，對整個PI3K/Akt信號通路的影響，還有待進一步研究證明。