胡方杰，喬麗娟，俞科賢，蒲小燕，永 勝，劉 燕，許玉珍，李積東

(青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西寧810001)

觀察發(fā)現(xiàn)，長期處于低氧環(huán)境下者機體免疫功能出現(xiàn)紊亂［1，2］。本研究采用模擬海拔5 000 m低氧和常氧對照條件分別飼養(yǎng)小鼠30天，通過測定各組小鼠脾臟指數(shù)、脾臟T淋巴細(xì)胞的數(shù)量及增殖能力和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(IL－4、IFN－γ)的含量，初步揭示低氧對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗研究對象為20只健康雄性BALB/c小鼠，5～7周齡，于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心購買［SCXK(陜)2012－003］，體重(15±1)g。主要試劑和儀器:抗小鼠CD3抗體(CD3－PE)、抗小鼠CD4抗體(CD4－FITC)、抗小鼠 CD28抗體(CD28－FITC、CD28－PerCP)及抗小鼠 CD8 抗體(CD8－Per-CP)(eBioscienc公司)，F(xiàn)BS(杭州四季青生物工程材料有限公司)，紅細(xì)胞裂解液、噻唑藍(lán)、RPMI1640培養(yǎng)基(Solarbio公司)，伴刀豆球蛋白A(Sigma公司)，IL－4/IFN－γ的 Elisa試劑盒(Trut Specialty Zeal公司);低壓氧艙室(中國貴州，DYC－3000)，流式細(xì)胞儀(BD公司，E34297600466，美國)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio－Rad公司，Coda型，美國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，380系列，美國)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建低氧動物模型

本實驗組別有低氧組(A)和常氧對照組(C)，每組10只。其中C組在平均海拔400 m的西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院飼養(yǎng)，A組在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心模擬5 000 m海拔的低壓氧艙中飼養(yǎng)，兩組小鼠飼養(yǎng)條件相同，常規(guī)分籠飼養(yǎng)30天。

1.2.2 檢測小鼠脾臟指數(shù)

稱重并記錄數(shù)據(jù)，給予兩組小鼠0.8 mL/100 g的10%烏拉坦行腹腔麻醉，無菌剖離獲取小鼠脾臟，去除脾臟表面附著的結(jié)締組織，稱重并記錄數(shù)據(jù)，計算小鼠脾臟指數(shù):即臟器指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠體重×100%。

1.2.3 制備小鼠脾臟細(xì)胞

將稱重過的脾臟迅速置于含有2 mL的Hanks液中剪成三段，研磨脾臟獲取細(xì)胞懸液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液并將其移至1.5 mL無菌離心管中，離心(1500r/min，4℃)5 min，棄上清液;加入紅細(xì)胞裂解液混勻靜置5 min，再離心(1500r/min，4℃)5 min棄上清液;用1 mL Hanks液清洗兩遍，每次均離心(1500r/min，4℃)5 min后棄上清液;用PBS將其制成細(xì)胞懸液，并用PBS調(diào)整其細(xì)胞濃度至 1.5×106個/mL，待用。

1.2.4 檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞數(shù)量

取500μL現(xiàn)制備好的細(xì)胞懸液置于流式管中作為陰性對照，再取500μL的細(xì)胞懸液與帶有熒光標(biāo)記的單克隆抗體混合均勻作為樣品管，避光靜置30 min 后離心(1500r/min，4℃)2 min，棄上清液，并用1 mL的PBS清洗3遍，再用500μL的PBS重新制成細(xì)胞懸液，按照流式細(xì)胞儀操作說明書操作，檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的分布情況。

1.2.5 檢測小鼠脾臟T細(xì)胞的增殖能力

在96孔板中依次加入 100μL終濃度為5μg/mL的 ConA 和濃度為 1.5×106個/mL的細(xì)胞懸液100μL(混勻)作實驗組，只加等體積細(xì)胞懸液者作陰性對照組，各設(shè)置3個復(fù)孔，于CO2培養(yǎng)箱(37℃、50mL/L)中培養(yǎng)48 h;將20μL MTT溶液加入各孔中培養(yǎng)4 h，離心棄上清液，再將150μL DMSO加入各孔中，低速震蕩15 min，最后使用酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔吸光度值。

1.2.6 檢測脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL－4、IFN－γ 的含量

收集已在37℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)48 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并按照IL－4、IFN－γ的Elisa試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光度值。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS22.0軟件，計量資料以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高原低氧促進(jìn)小鼠脾臟指數(shù)的升高

飼養(yǎng) 30 天后，C 組小鼠體重為(23.172±0.597)g，A 組小鼠體重為(19.718±0.541)g，A 組小鼠體重明顯低于C組小鼠(P＜0.001);A組小鼠脾臟凈重和C組無明顯差異(P=0.447)，但A組小鼠脾臟指數(shù)明顯高于 C 組(P＜0.001)(表1)。

表1 高原低氧對小鼠脾臟指數(shù)的影響值(±s)Table 1 The effects of high altitude hypoxia on the spleen index of mice(±s)

表1 高原低氧對小鼠脾臟指數(shù)的影響值(±s)Table 1 The effects of high altitude hypoxia on the spleen index of mice(±s)

指標(biāo) A組(n=10) C組(n=10) t P體重(g) 19.718±0.541 23.172±0.597 13.558 ＜0.001脾臟質(zhì)量(g) 0.088±0.006 0.090±0.005 0.777 0.447脾臟指數(shù)(%) 0.449±0.037 0.390±0.026 4.161 ＜0.001

2.2 高原低氧減少小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞數(shù)量

飼養(yǎng)30天后，A組小鼠脾臟 CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)明顯低于C組，且CD4+/CD8+T比值明顯降低，即CD4+T細(xì)胞數(shù)目下降程度明顯大于CD8+T細(xì)胞(P＜0.001，表 2，圖 1);A 組小鼠脾臟CD4+CD28+T細(xì)胞數(shù)明顯低于 C組(P＜0.001)，但兩組小鼠脾臟CD8+CD28+T數(shù)無明顯差異(P=0.080，表 2，圖 1)。

表2 高原低氧對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響值(±s)Table 2 The effects of high altitude hypoxia on the number of spleen T lymphocytes in mice(±s)

表2 高原低氧對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響值(±s)Table 2 The effects of high altitude hypoxia on the number of spleen T lymphocytes in mice(±s)

指標(biāo) A組(n=10) C組(n=10) t P CD3+T(%) 28.009±3.735 41.585±4.766 7.091 ＜0.001 CD4+T(%) 13.973±1.309 25.161±0.751 23.445 ＜0.001 CD8+T(%) 12.490±0.508 17.788±0.616 20.987 ＜0.001 CD4+/CD8+T 1.119±0.089 1.416±0.067 8.440 ＜0.001 CD4+CD28+T(%) 52.180±0.841 62.994±1.508 19.808 ＜0.001 CD8+CD28+T(%) 30.431±0.081 31.190±1.027 1.859 0.080

圖1 流式細(xì)胞儀檢測脾臟T細(xì)胞亞群分布圖Figure 1 Distribution of spleen T cell subsets detected by Flow cytometry

2.3 高原低氧抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力

同等條件下細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，在相同劑量ConA刺激下，A組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力明顯低于 C 組(P＜0.001，表 3)。

表3 高原低氧對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響結(jié)果(±s)Table 3 The effect of hypoxia on the proliferation of spleen T lymphocytes in mice(±s)

表3 高原低氧對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響結(jié)果(±s)Table 3 The effect of hypoxia on the proliferation of spleen T lymphocytes in mice(±s)

組別 n T細(xì)胞增殖(OD值) t P A C 10 0.202±0.049 10 0.319±0.045 5.603 ＜0.001

2.4 高原低氧對小鼠脾臟細(xì)胞分泌細(xì)胞因子存在不同影響

兩組培養(yǎng)小鼠脾臟細(xì)胞上清液內(nèi)IL－4含量無明顯差異(P=0.677)，但A組培養(yǎng)小鼠脾臟細(xì)胞上清液內(nèi) IFN－γ含量明顯低于 C組(P＜0.001)(表4)。

表4 高原低氧對小鼠脾臟細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響(±s)Table 4 The effects of hypoxia on cytokine secretion of spleen cells in mice(±s)

表4 高原低氧對小鼠脾臟細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響(±s)Table 4 The effects of hypoxia on cytokine secretion of spleen cells in mice(±s)

指標(biāo) A組(n=10) C組(n=10) t P IL－4 含量(mg/L) 200.700±29.963 195.700±22.236 0.424 0.677 IFN－γ 含量(mg/L) 298.000±27.060 435.500±39.039 9.154 ＜0.001

3 討論

T淋巴細(xì)胞是免疫細(xì)胞中含量最多，且功能最復(fù)雜的一類細(xì)胞，常被分為三個亞群即輔助性T細(xì)胞(CD4+T)、抑制性T細(xì)胞(Ts)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+T)，CD4+T細(xì)胞是免疫反應(yīng)的核心細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞是效應(yīng)細(xì)胞［3，4］。脾臟是 T淋巴細(xì)胞最主要的暫存外周免疫器官場所，脾臟的大小和生理功能在一定程度上可影響T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和免疫功能［5］。本實驗結(jié)果顯示低氧組小鼠脾臟指數(shù)高于常氧對照組，但兩組小鼠脾臟凈重之間無明顯差異。有研究表明低氧可通過減少內(nèi)源性大麻素的表達(dá)量以及瘦素的分泌量，抑制大鼠的攝食量，進(jìn)而出現(xiàn)體重降低的現(xiàn)象［6－8］。結(jié)合本實驗結(jié)果，低氧可能是通過降低體重進(jìn)而增加小鼠脾臟比例的。

本實驗結(jié)果顯示，低氧組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力較常氧對照組低。有研究表明，低氧可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡［9，10］。結(jié)合本實驗結(jié)果，低氧可能是通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡過程以及抑制T淋巴細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)而減少脾臟T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。CD4+T/CD8+T比值是映射機體免疫能力的指標(biāo)，二者的比值發(fā)生改變會導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)紊亂，甚至出現(xiàn)自身免疫性疾病［11，12］。田云梅等［13］發(fā)現(xiàn)，模擬海拔8 000 m低氧環(huán)境暴露6天，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率和壞死率顯著增加，且外周血及脾臟中CD8+T淋巴細(xì)胞變化不一，即出現(xiàn)細(xì)胞免疫功能紊亂的現(xiàn)象;而低氧組小鼠脾臟CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯低于常氧對照組，且CD4+T變化程度較CD8+T更為明顯。結(jié)合本實驗結(jié)果，低氧組出現(xiàn)CD4+T和CD8+T變化程度不一的現(xiàn)象可能與免疫功能紊亂有關(guān)。

按照CD28分子的表達(dá)情況，T細(xì)胞分為4類:CD4+CD28－、CD4+CD28+、CD8+CD28+和 CD8+CD28－。其中CD4+CD28+和CD8+CD28+T細(xì)胞依次是Th和CTL的主要細(xì)胞，二者的含量均會影響機體的免疫應(yīng)答結(jié)果，抗原提呈細(xì)胞表面B7分子與T細(xì)胞表面CD28分子的結(jié)合是激活T細(xì)胞的重要途徑［14］。本研究顯示低氧組小鼠脾臟CD4+CD28+T細(xì)胞比例明顯低于常氧對照組，而CD8+CD28+T細(xì)胞比例無明顯差異，說明低氧可能主要通過減少CD4+CD28+T細(xì)胞的比例影響機體免疫應(yīng)答。

IFN－γ由Th1細(xì)胞分泌，IL－4由 Th2細(xì)胞分泌，而Th1和Th2細(xì)胞均屬于CD4+T細(xì)胞。有研究表明低氧可同時減少外周血中CD4+T細(xì)胞數(shù)及IFN－γ和IL－4的含量，即Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞免疫平衡在低氧條件下被破壞［15，16］。而本研究發(fā)現(xiàn)兩組培養(yǎng)小鼠脾臟細(xì)胞的上清液中IL－4含量無明顯差異，但低氧組IFN－γ含量明顯低于常氧對照組，說明模擬5 000 m海拔低氧飼養(yǎng)小鼠30天時，低氧可能是主要通過減少CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而抑制淋巴細(xì)胞IFN－γ的分泌。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明模擬海拔5 000 m高原低氧暴露30天可使小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少，T淋巴細(xì)胞的增殖能力減弱，且減少細(xì)胞因子IFN－γ的分泌，進(jìn)而抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的免疫活性。