廖 瑜，王 瑋，2，馮 琳，2，湯 鋒，3* ，格日力，3#

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海西寧810001;2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，青海西寧810001;3.青海－猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810001)

高原紅細(xì)胞增多癥(High altitude polycythrmia，HAPC)的已知病理機(jī)制是慢性低氧刺激機(jī)體過度的紅細(xì)胞增生加重器官缺氧和損傷。紅系造血過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，以自我更新和分化為主，主要是紅系干祖細(xì)胞的增殖分化以及晚期紅系的分化。其中在紅系干祖細(xì)胞階段CD34(跨膜磷酸糖蛋白)通常被認(rèn)為是一個(gè)重要的標(biāo)記物［1］。

CD34+HSC是初期的造血祖細(xì)胞，并且具有很高的增殖潛力［2－3］。而 CD71可以認(rèn)為是早期的紅系祖細(xì)胞過渡為晚期紅系細(xì)胞過程中選擇性高表達(dá)的一個(gè)標(biāo)記物。Ter119主要標(biāo)記自早幼紅細(xì)胞分化至成熟紅系階段的細(xì)胞。CD71和Ter119常被用以標(biāo)記紅系在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)成熟過程［4］。低氧條件刺激CD34+細(xì)胞的增殖并且發(fā)現(xiàn)BFU－E的比率也顯著增高，說明低氧也能夠刺激 CD34+細(xì)胞的分化［5］。洪欣等［6］在 2003年研究證實(shí)，在 1%低氧條件可以促進(jìn)CD34+HSC的凋亡。目前低氧對(duì)于小鼠骨髓內(nèi)CD71+和TER119+的影響尚缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究擬做相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備

選用雄性BALB/c小鼠(許可證號(hào):SCXK2017－0001)，隨機(jī)將12只小鼠分為慢性低氧組和高海拔對(duì)照組。慢性低氧組小鼠造模參考文獻(xiàn)于青海大學(xué)低壓氧倉(cāng)(模擬海拔5500米)飼養(yǎng)30天(以下簡(jiǎn)稱低氧組)。高海拔對(duì)照組小鼠在青海西寧(海拔2260米)飼養(yǎng)30天(以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組)。兩組小鼠取血后，采用全自動(dòng)生化分析儀行血液學(xué)分析。

1.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞制備

依據(jù)文獻(xiàn)［8］使用小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞提取試劑盒(購(gòu)自天津?yàn)蠊?制備小鼠骨髓的單個(gè)核細(xì)胞。使用試劑盒中的F液沖洗出小鼠骨髓至離心管，用完全培養(yǎng)基重懸至6 mL。將細(xì)胞懸液按1:1的比例疊加于分離液上離心(2000r/min，25min)。吸出中間白色層的單個(gè)核細(xì)胞后，使用清洗液離心兩遍后備用。

1.3 小鼠骨髓單個(gè)核CD71+細(xì)胞比率檢測(cè)

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓單個(gè)核CD71+細(xì)胞比率。分離出兩組小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞分別計(jì)數(shù)后取出1×106個(gè)細(xì)胞，加入100μL的1×PBS重懸細(xì)胞后再加入CD71抗體(購(gòu)自BD公司)5μL，避光保存20 min后離心(1000r/min，5 min)清洗兩遍，再使用PBS重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 小鼠骨髓單個(gè)核Ter119+細(xì)胞比率檢測(cè)

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓單個(gè)核Ter119+細(xì)胞比率。分離出兩組小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞分別計(jì)數(shù)后取出1×106個(gè)細(xì)胞，加入100μL的1×PBS重懸細(xì)胞后再加入Ter119抗體(購(gòu)自BD公司)5μL，避光保存20 min后離心(1000r/min，5 min)清洗兩遍，再使用PBS重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 小鼠骨髓單個(gè)核CD71+細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓單個(gè)核CD71+細(xì)胞比率。分離出兩組小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞分別計(jì)數(shù)后取出 1×106個(gè)細(xì)胞，用 PBS離心(1000r/min，5min)清洗兩遍后，加入CD71抗體(購(gòu)自BD公司，5μL/mL)，避光保存20 min。然后使用凋亡試劑盒(購(gòu)自 BD 公司)，加入 FITC－AV(5μL/mL)、PI染液(5μL/mL)，避光保存20 min后，再加入試劑中的結(jié)合液(400μL)，樣本上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 小鼠骨髓單個(gè)核Ter119+細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓單個(gè)核Ter119+細(xì)胞比率。分離出兩組小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞分別計(jì)數(shù)后取出1×106個(gè)細(xì)胞，用PBS離心清洗兩遍后，加入Ter119抗體(購(gòu)自BD公司，5μL/mL)，避光保存20 min。然后使用凋亡試劑盒(購(gòu)自BD公司)，加入 FITC－AV(5μL/mL)、PI染液(5μL/mL)，避光保存20 min后，再加入試劑中的結(jié)合液(400μL)，樣本上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以珋x±s表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 低氧組與對(duì)照組小鼠血液學(xué)分析結(jié)果(表1)

表1 低氧組與對(duì)照組小鼠血常規(guī)分析結(jié)果(±s)Table 1 Blood routine analysis of Hypoxia and control group(±s)

表1 低氧組與對(duì)照組小鼠血常規(guī)分析結(jié)果(±s)Table 1 Blood routine analysis of Hypoxia and control group(±s)

分組 n RBC(1012/L) HGB(g/L) HCT(%) WBC(109/L) RET(109/L)低氧組 6 13.32±1.69 218.00±13.93 68.3±1.76 6.36±1.84 151.31±112.85對(duì)照組 6 6.78±0.71 155.00±6.57 53.77±2.19 5.60±3.58 293.43±159.88 T 8.764 10.020 12.676 0.431 －1.723 P 0.000 0.000 0.000 0.677 0.120

低氧組與對(duì)照組小鼠血液學(xué)分析結(jié)果顯示，低氧組 RBC、HGB、HCT 均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。而WBC和 RET(網(wǎng)織紅細(xì)胞)沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 小鼠骨髓單個(gè)核的CD71+細(xì)胞比率(圖1)

圖1 低氧組與對(duì)照組小鼠骨髓單核細(xì)胞CD71陽(yáng)性細(xì)胞率Figure 1 The ratio of CD71+cells in mouse bone marrow mononuclear cells

兩組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的CD71+細(xì)胞的流式結(jié)果顯示，低氧組小鼠模型分離出的骨髓單個(gè)核CD71+細(xì)胞比率較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)。說明慢性低氧條件可以促進(jìn)小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD71+細(xì)胞增殖分化。

2.3 小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞Ter119+細(xì)胞比率(圖2)

圖2 低氧組與對(duì)照組小鼠骨髓單核細(xì)胞Ter119陽(yáng)性細(xì)胞率Figure 2 The ratio of Ter119+cells in mouse bone marrow mononuclear cells

兩組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的CD71+細(xì)胞的流式結(jié)果顯示，低氧組小鼠模型骨髓單個(gè)核細(xì)胞Ter119+細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)。說明慢性低氧條件可以促進(jìn)小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞Ter119+細(xì)胞增殖分化。

2.4 小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞 CD71+細(xì)胞凋亡率(圖3)

圖3 低氧組與對(duì)照組小鼠骨髓單核細(xì)胞CD71陽(yáng)性細(xì)胞凋亡率Figure 3 Apoptosis of CD71+cells in mouse bone marrow mononuclear cells

兩組小鼠骨髓單個(gè)核CD71+細(xì)胞凋亡率流式結(jié)果顯示，低氧組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD71+細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著增加且有差異(P＜0.01)。慢性低氧條件下觀察到小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD71+細(xì)胞凋亡率增加。

2.5 小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞 Ter119+細(xì)胞凋亡率(圖4)

圖4 低氧組與對(duì)照組小鼠骨髓單核細(xì)胞Ter119陽(yáng)性細(xì)胞凋亡率Figure 4 Apoptosis of Ter119+cells in mouse bone marrow mononuclear cells

兩組小鼠骨髓單個(gè)核Ter119+細(xì)胞凋亡率流式結(jié)果顯示，低氧組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞Ter119+細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著增加且有顯著性差異(P＜0.01)。慢性低氧條件下觀察到小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD71+細(xì)胞凋亡率增加。

3 討論

成年人的造血器官主要是骨髓，并且骨髓是一個(gè)生理性的氧含量較低的組織，HSC主要留駐在氧供應(yīng)量有限的壁龕內(nèi)［9－10］。造血干細(xì)胞的自我更新與分化是相對(duì)重要的特性，受到胞內(nèi)與胞外信號(hào)的影響調(diào)控。據(jù)報(bào)道［11］，健康成人骨髓穿刺得到平均pO2為54.9±0.98 mmHg，平均 SpO2為87.5%±1.1%。而使用光纖探針檢測(cè)小鼠的HSC所在的壁龕內(nèi)的pO2僅為18 mmHg［12］。以上數(shù)據(jù)提示骨髓局部低氧微環(huán)境對(duì)HSC的維持以及髓內(nèi)造血均有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)［13］，5%低氧濃度模擬骨髓低氧環(huán)境培養(yǎng)CD34+HSC能夠產(chǎn)生較多的造血干細(xì)胞CD34+AC133+HSC，并且觀察到造血干細(xì)胞的凋亡率明顯降低。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)低氧條件刺激的CD34+HSC有更好的增殖潛力。由于目前缺乏有關(guān)低氧刺激對(duì)骨髓CD71+、Ter119+細(xì)胞作用的相關(guān)內(nèi)容，故本研究提出在慢性低壓低氧刺激30天的Balb/c小鼠為模型，觀察慢性低氧對(duì)其骨髓有核紅細(xì)胞分化及凋亡的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)血液分析結(jié)果提示，慢性低氧條件小鼠模型RBC、HGB、HCT三個(gè)指標(biāo)顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，符合文獻(xiàn)中HAPC動(dòng)物造模成功的條件。本研究結(jié)果顯示，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)慢性低氧條件下的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的CD71+和 Ter119+細(xì)胞顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，說明慢性低氧刺激能夠促進(jìn)小鼠骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞向紅系的成熟階段分化增殖。

有文獻(xiàn)報(bào)道［14］，小鼠在高海拔地區(qū)骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的凋亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。本研究結(jié)果顯示，慢性低氧條件下低氧組小鼠模型骨髓單個(gè)核細(xì)胞的凋亡率均顯著增加，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。并且本研究觀察到小鼠骨髓的有核紅細(xì)胞向成熟的紅系階段分化，即CD71+、Ter119+細(xì)胞凋亡率增高，進(jìn)一步提示慢性低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)有核紅細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。但孫敏敏等報(bào)道［15］，慢性高原病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的凋亡率低于健康人群;鄒春華等報(bào)道［16］，采用HAPC患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，其凋亡率明顯少于正常組。以上結(jié)果與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，分析原因可能有以下幾點(diǎn):一是本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物模型與人體有差異;二是本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)造的慢性低氧動(dòng)物模型是參考了文獻(xiàn)后設(shè)置的海拔高度和低氧時(shí)間(低壓氧艙模擬海拔5500m，30天)［17］，由于模擬時(shí)間較短，小鼠可能尚處于機(jī)體抵抗過度紅細(xì)胞增生的負(fù)反饋代償狀態(tài)，并未達(dá)到高原紅細(xì)胞增多癥的病理狀態(tài)。