馬 蘭，劉川川，周 振，宋澤青，劉 潔，格日力*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海西寧810001;2.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室，青海西寧810001;3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，青海西寧810001)

低氧性肺動脈高壓(Hypoxic Pulmonary Hypertension，HPH)是高原適應(yīng)生理的重要表現(xiàn)，而顯著的肺動脈高壓又是慢性肺源性心臟病和各型高原病(高原肺水腫、高原紅細胞增多癥、高原心臟病等)發(fā)病的重要病理生理變化之一，是一種潛在的早期高原病，且病情越重，HPH越明顯。在慢性HPH形成早期，肺血管收縮是主要因素，隨著缺氧時間的延長，肺血管結(jié)構(gòu)重建也參與其中，低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建(hypoxic pulmonary vascular remodeling，HPVR)是慢性HPH的重要病理生理基礎(chǔ)。然而，目前HPH的發(fā)病機制仍不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長度只有～23nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在動物種系發(fā)生中具有保守序列，在基因表達的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年來，miRNA在肺動脈高壓肺血管重塑中的作用備受關(guān)注，并且對于miRNA與HPH的研究越來越受到重視。越來越多的研究表明，miRNA有望作為肺動脈高壓治療的新靶點。miR－34a是一個有多種功能的miRNA，在許多疾病的病理生理中發(fā)揮著重要作用。最新研究顯示［1］，miR－34a在多種心血管疾病中存在異常表達。還有研究報道［2］，miR－34a在干細胞分化為平滑肌細胞過程中顯著升高，并發(fā)現(xiàn)miR－34a在促進平滑肌細胞分化中起重要作用。另有研究也已證實P53能夠顯著地誘導(dǎo)miR－34a的轉(zhuǎn)錄，且P53基因敲除的小鼠在低氧誘導(dǎo)下易發(fā)生HPH及肺血管重構(gòu)［3］。

本研究旨在觀察隨著HPH肺血管重建過程中肺組織miR－34a和P53基因的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇

從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司訂購雄性SD大鼠40只，體重140～160 g(動物合格證號:11400700115390)。運回西寧后隨機分為常氧對照組和低氧第1 wk組、第2 wk組和第3 wk組，每組10只。

1.2 實驗試劑及儀器選擇

Rn－miR－34a primer(MS00000224)、Rn－U6 primer(MS00033740)、P53 primer QT00193522、18sRNAPrimer(QT00199374)、miScript II RT kit、miScript SYBR Green PCR kit及QuantiFast SYBR Green PCR kit均購自Qiagen公司;Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購自TIANGEN公司，Anti－P53兔多克隆抗體、Anti－a－tubulin兔多克隆抗體及二抗均購自Abcam公司，BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒均購自Pierce公司。

MP150十六導(dǎo)生理記錄儀購自美國Biopac公司，ABI7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，AI 600成像儀購自美國GE公司，石蠟切片機購自德國Leica公司。

1.3 低氧性肺動脈高壓動物模型構(gòu)建

將低氧組SD大鼠置于青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心低壓氧艙(模擬海拔5000m)，構(gòu)建隨時間推移低氧性肺動脈高壓肺血管重建的實驗動物模型，分別在低氧第1、2、3周取材并進行各項指標(biāo)的檢測。正常對照組在低壓氧艙外正常飼養(yǎng)。

1.4 生理學(xué)和血流動力學(xué)指標(biāo)的測定

分別在低氧處理的第1、2和3周，用10%烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉(10mg/kg)大鼠，其頸前皮膚用75%的酒精消毒后，切開游離右側(cè)頸外靜脈。將一個充盈0.1%肝素鹽水的7號Swan－Ganz管從右側(cè)頸外靜脈插入，并緩慢將其推至右心室然后進入肺動脈，測平均肺動脈壓;導(dǎo)管另一端連接壓力換能器，將信號輸入16導(dǎo)生理信號采集系統(tǒng)，根據(jù)壓力圖形判斷插管位置，以監(jiān)測實驗動物的肺動脈壓的變化。

1.5 心臟重量、左右心室重量比的測定及取材

待測定完上述相關(guān)生理指標(biāo)后，將大鼠放血處死，迅速打開胸腔，取出心臟稱重，剪去右心房組織，沿室間隔邊緣剪下右心室，分別稱取右心室游離壁(RV)和左心室與室間隔(LV+S)重量，計算RV/(LV+S)重量比，作為右室肥大指標(biāo)。同時，取大鼠左側(cè)肺組織，用4%的多聚甲醛固定，用于形態(tài)學(xué)測定;取出右肺組織，剪成小塊組織后迅速保存在液氮中，用于分子生物學(xué)研究。

1.6 大鼠肺組織的HE染色

將固定好的肺組織常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(4μm)，用蘇木素－伊紅(HE)進行染色，觀察不同低氧時間下肺小動脈形態(tài)學(xué)變化特征并拍照。

1.7 肺組織中總RNA的提取

從液氮中取出保存的肺組織塊，準確稱取50 mg，按照Trizol試劑盒說明書，一步法提取各組大鼠肺組織總RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計測定A260和A280純度及濃度、甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析檢測完整性。

1.8 肺組織中miR－34a表達水平的檢測

取上述總RNA 2μg，嚴格按照miScriptII RT kit試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。以此cDNA鏈為模板，嚴格按照miScript SYBR Green PCR kit試劑盒說明書，建立miR－34a和內(nèi)參U6的反應(yīng)體系，且每個樣本均設(shè)三個復(fù)孔。在ABI7500熒光定量PCR上進行PCR反應(yīng)，條件為(1)95℃，5 min;(2)95℃，10 sec，55 ℃，15 sec，60 ℃ 30 sec，40 個循環(huán);(3)熔解曲線的采集在以上PCR反應(yīng)結(jié)束后，以每10 sec上升0.5℃的速度從60℃到95℃來記錄線。

1.9 肺組織中P53 mRNA水平的檢測大鼠

取上述總RNA 2μg，嚴格按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。并以此cDNA第一鏈為模板，嚴格按照QuantiFast SYBR Green PCR kit試劑盒說明書，建立P53和內(nèi)參18s rRNA的反應(yīng)體系，且每個樣本均設(shè)三個復(fù)孔。然后在ABI7500熒光定量PCR上進行PCR反應(yīng)，條件為(1)95℃，5 min;(2)95℃，10 sec，60℃，30 sec，40個循環(huán);(3)熔解曲線的采集在以上PCR反應(yīng)結(jié)束后，以每10 sec上升0.5℃的速度從60℃到95℃來記錄線。

1.10 肺組織中P53蛋白水平的檢測

從液氮中取出保存的肺組織，各稱取50 mg，加入一定比例的RIPA裂解液(含1mM的PMSF)，勻漿并提取肺組織總蛋白。用BCA蛋白定量法測定組織樣本總蛋白濃度，每個樣品取20μg上樣，在5%濃縮膠和10%聚丙烯酰胺分離膠中進行電泳，電泳結(jié)束后用 Bio－Rad半干電轉(zhuǎn)儀(恒壓10V，20～30min)轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用新鮮配制的5%的脫脂奶粉室溫封閉 2 h，加入 P53兔多克隆抗體(1:2000)、抗α－tubulin兔多克隆抗體(1:2000)過夜(4℃)。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL發(fā)光液發(fā)光，用成像儀進行熒光成像并拍照。用P53目的條帶與內(nèi)參α－tubulin條帶的灰度值之比作為P53蛋白的相對表達量，并用Quantity one分析軟件進行灰度值分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用珋x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 右心室比重和平均肺動脈壓

結(jié)果如表1所示，隨著低氧處理時間的延長大鼠平均肺動脈壓(mPAP)明顯增加，與常氧對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。且右心室占全心的比重RV/(LV+S)也明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，提示隨著低氧時間延長，大鼠肺動脈壓逐漸增高并伴有右心室肥厚的表現(xiàn)，說明隨著在低壓氧艙中缺氧時間的延長，低氧性肺動脈高壓動物模型基本構(gòu)建成功。

2.2 肺小動脈形態(tài)學(xué)特征

如圖1所示，隨低氧時間的延長大鼠肺小動脈壁逐漸增厚(圖中黑色箭頭所示)，尤其是中間平滑肌細胞增殖明顯，顯示我們利用低壓氧艙模擬海拔5 000 m構(gòu)建低氧性肺動脈高壓肺血管重建的模型成功。

表1 低氧處理組和對照組右心室比重和平均肺動脈壓的比較結(jié)果(±s)Table 1 Comparison of RV/(LV+S)and mPAP among hypoxic groups with control(±s)

表1 低氧處理組和對照組右心室比重和平均肺動脈壓的比較結(jié)果(±s)Table 1 Comparison of RV/(LV+S)and mPAP among hypoxic groups with control(±s)

*:P＜0.001 Vs對照組.

組別 n RV/(LV+S) mPAP(mmHg)對照組 10 0.27±0.04 10.99±2.53低氧 1wk 組 10 0.41±0.05*32.67±3.28*低氧 2wk 組 10 0.53±0.04* 32.11±8.88*低氧 3wk 組 10 0.55±0.06* 40.38±3.74*F 71.903 38.543 P 0.000 0.000

圖1 大鼠肺組織HE染色圖(×200)Figure 1 The HE staining of lung among hypoxic groups and control group

2.3 miR－34a在不同低氧大鼠肺組織中的表達情況

達量隨著低氧時間的延長在2wk和3wk明顯增高，差異有顯著性(P＜0.05)。

結(jié)果如表2所示，大鼠肺組織中miR－34a的表

表2 qPCR法檢測各組肺組織中miR－34a的相對表達量(±s)Table 2 Relative expression of miR－34a in lung tissues of rats in each group by qPCR(±s)

表2 qPCR法檢測各組肺組織中miR－34a的相對表達量(±s)Table 2 Relative expression of miR－34a in lung tissues of rats in each group by qPCR(±s)

*:P＜0.05 Vs 常氧對照組.

組別 n 2－△△Ct常氧對照組 10 1.00±0.08低氧 1wk 組 10 0.93±0.03低氧 2wk 組 10 1.72±0.16*低氧 3wk 組 10 2.32±0.26*F 16.232 P 0.000

2.4 P53基因在不同低氧大鼠肺組織中的表達情況

2.4.1 各組大鼠肺組織中P53 mRNA的表達

結(jié)果如表3所示，在低氧1wk開始P53 mRNA表達開始增加，低氧3wk的表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 qPCR法檢測各組肺組織中P53mRNA的相對表達量(±s)Table 3 Relative expression of P53 mRNA in lung tissues of rats in each group by qPCR(±s)

表3 qPCR法檢測各組肺組織中P53mRNA的相對表達量(±s)Table 3 Relative expression of P53 mRNA in lung tissues of rats in each group by qPCR(±s)

*:P＜0.05 Vs常氧對照組.

組別 n 2－△△Ct常氧對照組 10 1.00±0.11低氧 1wk 組 10 1.20±0.15低氧 2wk 組 10 1.39±0.17低氧 3wk 組 10 1.50±0.23*F 1.876 P 0.163

2.4.2 各組大鼠肺組織中P53蛋白的表達

結(jié)果如圖2、表4所示，與常氧對照組相比，低氧各組大鼠肺組織中P53蛋白的表達明顯增高，尤其是在低氧2wk和3wk時顯著增高，差異有顯著性(P＜0.001)，這一結(jié)果與mRNA的表達水平是一致的。

圖2 Western blot法檢測各組大鼠肺組織中P53蛋白水平表達圖Figure 2 Expression of P53 protein in lung tissue of rats in each group by Western blot

表4 各組大鼠肺組織中P53蛋白水平相對表達量的比較(±s)Table 4 Comparison of the relative expression of P53 protein in the lung tissue of rats in each group( ±s)

表4 各組大鼠肺組織中P53蛋白水平相對表達量的比較(±s)Table 4 Comparison of the relative expression of P53 protein in the lung tissue of rats in each group( ±s)

*:P＜0.001Vs常氧對照組.

組別 n P53/α－tubulin 灰度值常氧對照組 10 0.27±0.07低氧 1wk 組 10 0.36±0.07低氧 2wk 組 10 0.68±0.07*低氧 3wk 組 10 1.14±0.09*F 26.775 P 0.000

3 討論

高原環(huán)境有許多不利于人的因素，尤以低氧最為嚴重。長期生活工作在高原的人即使度過最初的不適應(yīng)階段，但隨著時間的延續(xù)可產(chǎn)生代償性的系列反應(yīng)，少數(shù)人可產(chǎn)生嚴重的器官病理改變，導(dǎo)致所謂的“慢性高原病”。HPH是慢性高原病的一種常見病，其主要病理化特征是缺氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)(hypoxic pulmonary vessel remodeling，HPVR)［4］。在肺血管重構(gòu)過程中，肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增生肥大，細胞外基質(zhì)合成增多，非肌型動脈肌化形成肌型動脈及外膜成纖維細胞增殖等導(dǎo)致肺小動脈管壁變厚、內(nèi)徑變窄，最終使肺血管阻力持久升高，造成持續(xù)性肺動脈壓力升高［5］。如果長期持續(xù)的肺動脈高壓得不到有效緩解，容易引發(fā)右心室代償性肥厚，嚴重者甚至發(fā)展為右心衰竭。因此，研究 HPH的發(fā)病機理，對防治與其相關(guān)的心肺疾病具有重要的臨床意義。

有效制備HPH動物模型是研究HPH分子機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。然而，目前國內(nèi)研究HPH制作動物模型的方式多采用間斷常壓低氧、持續(xù)常壓低氧、間斷低壓低氧等方法［6］，主要是采用自制的小型艙體，用氮氣、二氧化碳及氧氣等混合后通過控制氣體流量使氧流量控制在10%左右，即為常壓低氧;或者用小型真空泵抽出艙內(nèi)空氣從而達到預(yù)設(shè)的低氧條件，即低壓低氧。然而，上述方法的缺點在于艙體太小，動物樣本有限，氧濃度的維持時間和準確度較難控制。在本課題研究中，我們采用全自動數(shù)控的大型低壓氧艙來模擬高原，24 h全程自動化調(diào)控，保持一定的海拔高度，避免了人為操作誤差導(dǎo)致的氧濃度不準確。由于缺氧方式和時間不同，造成的肺動脈高壓模型也不同。因此，這種造模方法更接近于高原低壓低氧環(huán)境的暴露。

本實驗中，我們采用大型低壓氧艙模擬海拔5 000 m，分別在低氧1、2、3周后用頸外靜脈插管法測定mPAP來觀察肺動脈壓力情況;用RV/(LV+S)來評定右室肥厚;并用肺組織形態(tài)學(xué)觀察肺小動脈重建情況，從而判定HPH肺血管重建動物模型是否構(gòu)建成功。我們的研究結(jié)果顯示，在低氧第1周開始，mPAP明顯增加，右心室也有肥厚的表現(xiàn)，而從肺組織切片中并沒有明顯的肺小動脈壁增厚的表現(xiàn)，提示在低氧1周時大鼠肺動脈壓力升高，但是并沒有肺血管重建的形成。說明在缺氧早期肺動脈壓力的升高主要是以肺血管收縮為主，且右心室出現(xiàn)生理代償性肥厚，這是一種代償反應(yīng)，即通過肺血管收縮引起肺動脈壓力升高從而達到最佳適應(yīng)。然而，隨著低氧時間的延長，在第2周和第3周不僅表現(xiàn)在mPAP的顯著升高和右心室的肥厚，肺小動脈壁也明顯增厚，出現(xiàn)了明顯的肺血管重建。提示在低氧第2～3周即可成功構(gòu)建出HPH肺血管重建動物模型。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)［7］，缺氧環(huán)境下miRNAs表達改變能調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細胞增殖、凋亡、遷移等功能，并參與缺氧肺動脈高壓的形成。因此，對于miRNAs與低氧性肺動脈高壓的研究越來越受到重視。Caruso等人［8］用基因芯片技術(shù)在缺氧造成的肺動脈高壓大鼠肺組織中篩選得到上百個miRNAs的表達，且體外實驗已證實，miR－21［9］、miR－204［10］、miR－26a［11］、miR－24［12］以及 miR－146a［13］等可直接誘導(dǎo)血管平滑肌增殖，并且參與血小板衍生生長因子(PDGF)、骨形成蛋白(BMPs)等促增殖因子引起的細胞增殖。相反，另一些miRNAs，如miR－143和miR－145 等［14、15］具有抑制平滑肌細胞增殖的作用并可顯著抑制血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)變和受損血管的重構(gòu)。而miR－34a因具有調(diào)控細胞周期及細胞凋亡的作用而備受關(guān)注。特別是在腫瘤研究中，調(diào)控細胞周期進而影響細胞增殖、凋亡、衰老等過程。然而，有學(xué)者研究了miR－34a在干細胞分化平滑肌細胞中的作用時，發(fā)現(xiàn)miR－34a可促進小鼠和人胚胎干細胞分化為血管平滑肌細胞，提示miR－34a在血管平滑肌細胞中可能有重要功能［2］，有學(xué)者在此基礎(chǔ)上進一步研究發(fā)現(xiàn)［16］，miR－34a能夠調(diào)控血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化，即抑制血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化后的增殖及遷移能力，且在血管損傷修復(fù)及重塑中發(fā)揮重要作用。而我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在隨著低氧時間延長，HPH肺血管重建逐漸形成的過程中，大鼠肺組織中的miR－34a的表達逐漸增高，提示miR－34a可能在HPH形成過程中發(fā)揮著重要的作用。已有研究證實，P53能夠顯著地誘導(dǎo)miR－34a的轉(zhuǎn)錄，且P53基因敲除的小鼠在低氧誘導(dǎo)下易發(fā)生HPH及肺血管重構(gòu)［3］。我們的研究結(jié)果顯示，隨著低氧時間延長，HPH肺血管重建逐漸形成的過程中，大鼠肺組織中 P53基因不僅在mRNA水平，而且在蛋白水平表達也顯著增高，這與彭利靜［17］等人的研究結(jié)果是一致的，提示在HPH肺血管重建過程中miR－34a可能受P53基因的調(diào)控和表達。因此，通過本實驗研究，我們推測miR－34a可能參與了HPH肺血管重建的過程，其調(diào)控機制尚待進一步研究探索。