許帥強，孫迪，邵俊花，劉登勇*

1(渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)(沈陽農業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽，110866)

在肉制品的加工過程中常常添加一些鹽類，如食鹽，鎂鹽與鈣鹽等，通過影響肌肉蛋白質的構象來改變肌肉蛋白質的功能特性，最終改善肉制品的品質[1]。蛋白質的構象變化研究是理解蛋白質功能變化不可或缺的重要環(huán)節(jié)，因為蛋白質特定的生理活性和功能在很大程度上由其構象決定。在肉制品加工及品質控制基礎理論研究中，對肌肉蛋白質的二級結構等變化情況進行測定，再結合肌肉蛋白質凝膠品質的相關變化規(guī)律，可構建肌肉蛋白質二級結構等構象變化和凝膠品質間的關系，進而快速預測肌肉蛋白質凝膠的品質[2]。因此研究斬拌過程中不同鹽處理對肉糜凝膠蛋白質的構象變化和水合特性的影響具有一定的指導意義。

作為一種快速、無損的檢測方法，低場核磁已在食品工業(yè)的多方面用于樣品水分相關性質的檢測包括煮制對產品的影響，不同的冷凍、貯藏條件對于各種肉制品相關品質的影響。此外，低場核磁還可用于快速評價豬肉的質量等[3-4]。低場核磁可測定高水分含量樣品的水分狀態(tài)，明確水分在不同樣品中的分布情況，進而反映肉中水分-蛋白質之間的相互作用[5]。通過運用該方法，明確水分分布與水分遷移轉變規(guī)律，可有助于理解不同鹽處理對產品主要品質特性的影響[6-7]。

蛋白質二級結構主要是指蛋白質分子局部區(qū)域內，多肽鏈沿一定的方向盤繞和折疊的方式：主要是分子內氫鍵維系的局部空間排列，包括α-螺旋和β-折疊、β-轉角、無規(guī)卷曲等[8]。傅里葉紅外吸收光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)屬于分子振動吸收光譜，可以根據(jù)蛋白質等生物大分子對應的紅外光譜特征吸收峰的譜型、強度、頻率等譜學參數(shù)變化，來分析不同狀態(tài)、不同濃度及不同環(huán)境中的蛋白質和多肽的二級結構，而且為蛋白質的變性過程以及蛋白質分子間相互作用研究提供便利的手段[9-11]。同時蛋白質和多肽在紅外光譜圖上會顯示出不同振動頻率的酰胺帶，位于1 700～1 600 cm-1的峰為酰胺I帶(amide I)，位于1 600～1 500 cm-1處的峰為酰胺Ⅱ帶(amide Ⅱ)[1]。其中，酰胺I帶對于蛋白質二級結構的研究最有價值，主要通過對羰基伸縮振動和氫鍵結構的反映提供關于蛋白質骨架的詳細信息，常用于研究蛋白質的折疊，解折疊以及聚合情況[2]。另外，1 330～1 220 cm-1的酰胺Ⅲ帶也被用于歸屬蛋白質的二級結構并探討其內部氫鍵結合情況[12]。

該研究按照以肉糜乳化凝膠為對象，利用低場核磁共振技術對不同鹽處理肉糜乳化凝膠的H1質子的遷移規(guī)律進行分析，進而分析蛋白質的水合特性；對肉糜進行紅外吸收光譜測試，檢測水合階段蛋白質空間構象包括蛋白質二級結構以及微環(huán)境的變化規(guī)律，確定水合狀態(tài)對豬肉糜蛋白質分子構象變化的影響。在肉制品加工及品質控制的基礎理論研究中，跟蹤斬拌過程中氫質子遷移變化規(guī)律，建立水合特征與分子構象變化關系，揭示水分子在溶解和溶脹過程對蛋白分子構象變化和分子間交聯(lián)的影響，尤其是蛋白-蛋白分子間交聯(lián)與蛋白-水分子間交聯(lián)，再結合肌肉蛋白質凝膠品質的相關變化規(guī)律，可明確斬拌過程中鹽類、水分與蛋白質作用的相關性，為健康的乳化性肉制品開發(fā)和品質控制奠定基礎，促進肉類加工的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長肌，購于當?shù)卮鬂櫚l(fā)超市；食鹽(NaCl)、復合磷酸鹽(三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉，質量比1∶1∶1)，均為分析純。

1.2 儀器與設備

TJ12-H絞肉機，廣東恒聯(lián)食品機械制有限公司；Stephan-M5低溫真空斬拌機，德國Stephan機械有限公司；SY-1230恒溫水浴槽，上海滬粵明科學儀器有限公司；BCD-215KALM海爾立式冷藏柜，青島海爾股份有限公司；低場核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；Allegra 64R低溫高速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凝膠樣品制備

制備程序參照YOUSSEF的方法[13]，稍加改動。對經(jīng)過前處理的豬背最長肌，首先用孔徑為6 mm的絞肉機絞碎得到碎肉；再將絞碎的豬背最長肌(1 000 g)與食鹽(50 g)、磷酸鹽(6.25 g)一起放入乳化斬拌機中高速(3 000 r/min)斬拌1 min，靜止2 min以提取鹽溶性肌原纖維蛋白；向乳化機中加入冰水(500 g)繼續(xù)斬拌2 min，獲得肉糜。

在斬拌階段按照4種方式：不加食鹽與磷酸鹽、只加食鹽、只加磷酸鹽、加食鹽+磷酸鹽，分別加入預先絞碎的豬背最長肌高速真空斬拌1 min后，停留2 min，加冰水(1∶1，500 g)后繼續(xù)真空斬拌2 min后取樣，即得到不同鹽處理方式的肉糜。

對得到的不同鹽處理方式的肉糜(空白組、食鹽組、磷酸鹽組、食鹽+磷酸鹽組)，分別從斬拌好的相應肉餡中稱取質量約35 g的肉糜，置于50 mL帶螺旋蓋的離心管中，低速(1 800 r/min)4 ℃離心5 min，以驅除肉糜中的氣泡，然后加蓋密封。75 ℃恒溫水浴30 min，取出離心管。靜置1 h冷卻后取樣。

1.3.2 低場核磁共振分析

使用低場核磁共振分析儀對蛋白質的水合特性進行分析，研究蛋白質和水分中的1H質子相互交換和遷移的規(guī)律，用以表征蛋白質的水合特征。方法依據(jù)BERTRAM等[14]，稍作變動。

測試樣品為：不同鹽處理的加熱肉糜。測試條件：質子共振頻率為22 MHz，測量溫度為32 ℃。首先確定測試參數(shù)為：重復掃描32次，重復間隔時間TR為3 000 ms，采樣間隔150 μs，回波個數(shù)2 500。每個樣品平行測定5次，實驗重復3次。

樣品的測試步驟如下：取2 g肉糜，直接放入15 mm直徑的核磁管，然后插入分析儀進行分析。

自旋-自旋弛豫時間T2采用CPMG序列進行測量。CPMG得到的指數(shù)衰減曲線用儀器自帶的MultiExplnv Analysis軟件進行T2反演，得到T2值。反演結果為生成的弛豫圖和各個弛豫過程的弛豫幅值、其對應時間常數(shù)(峰值)及其所占面積分數(shù)、每個峰的起始時間和結束時間。為了分析方便，弛豫圖中每個組分的峰值對應時間作為T2。每個組分峰值對應的曲線面積，通過累積積分后作為每個組分對應的峰面積，每個組分峰面積所占總峰面積的峰比例P2可表征對應水分的相對含量。

1.3.3 傅里葉紅外吸收光譜測試

將制得的不同鹽處理加熱后的樣品，經(jīng)冷凍干燥72 h后研磨成粉，采用傅里葉變換紅外光譜儀測定試樣的FT-IR譜圖，KBr壓片測定。光譜范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，信號掃描累加次數(shù)32次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對反演過的T2和P2數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，方差分析采用單因素ANOVA分析，數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的多重比較采用LSD法，不符合正態(tài)分布的用Tamhane,s-T2(M)檢驗，差異顯著性為p<0.05。

對得到的FT-IR譜圖，譜峰擬合采用Peakfit V 4.12擬合軟件。作圖采用Sigmaplot 12.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同鹽處理肉糜加熱后的水合特性分析

本實驗中，新鮮的豬背最長肌經(jīng)歷不同鹽處理斬拌加熱后，T2弛豫時間變化不一。按照弛豫時間T2由低到高看，分別對應與大分子緊密結合水(T2b<10 ms)，處在肌原纖維網(wǎng)狀結構粗絲與細絲之間的不易流動水(T21, 10～100 ms)以及肌原纖維網(wǎng)狀結構外的游離水(T22>100 ms)。弛豫時間越短，表明該部分水分的流動性越差，而弛豫時間越長則對應流動性越好的那部分水分，弛豫時間越長，代表該種水分被蛋白質束縛越不緊密[15-17]。

由圖1可以看出，與空白組相比，食鹽與食鹽+磷酸鹽處理組的T21與T22均顯著(p<0.05)增加，即該兩種相態(tài)水分的流動性顯著高于未加任何鹽處理的空白組，而該兩種相態(tài)水分在磷酸鹽單獨添加的肉糜組與空白組中差異不顯著(p>0.05)。

圖1 不同鹽處理對肉糜加熱后T2弛豫時間的影響Fig.1 Effect of different salt treatments on the heated meat batters relaxation time T2注：標注有不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖2為不同鹽處理肉糜的弛豫組分峰面積比例的變化情況。依據(jù)弛豫組分峰面積百分比，可以估算氫質子的相對含量，從而反映不同狀態(tài)水分群的相對含量，然后根據(jù)不同狀態(tài)水分群含量的變化情況，可以進一步評估各種狀態(tài)水分群的遷移情況[18]。

肉糜加熱后，由圖2可以看出，食鹽+磷酸鹽處理組的加熱凝膠結合水相對含量顯著低于其他處理組，不易流動水含量與食鹽組差異不顯著(p>0.05)但均顯著高于另外兩組處理結果，自由水含量則顯著低于空白處理。

圖2 不同鹽處理對肉糜加熱后弛豫峰比例P2的影響Fig.2 Effect of different salt treatments on the heated meat batters peak area proportion P2

斬拌過程中添加鹽類對于鹽溶性蛋白質的提取至關重要，溶解性和蛋白質結構的變化有很大的關系[19]，鹽溶蛋白的提取程度勢必影響蛋白質的溶脹情況及隨后的乳化過程，最終對產品的品質比如多汁性、嫩度等造成影響[1]。研究表明：鹽離子可選擇性地與暴露在蛋白表面的相反電荷結合，破壞肌球蛋白分子之間的離子鍵，使得蛋白分子與水分子的親和力增加，蛋白質溶解[20]。另一方面，添加的鹽類使得肌原纖維蛋白膨脹，增加了肌絲纖維之間的空隙，肌絲纖維對水分的截留能力減弱，促進了鹽溶性蛋白的溶解形成溶膠，因此造成弛豫時間的增加，表現(xiàn)為水分的流動性得到增強[21]。本實驗結果也表明鹽類的加入使得主要水分流動性增強，與蛋白質的作用幾率增大，可能使得水合作用更加充分以形成產品較好的質地。

不易流動水，作為水分在肌肉中的主要(80%)存在形式，是肌肉的主要水分，這部分水分取決于肌原纖維蛋白質凝膠的網(wǎng)狀結構變化，是反映肌肉系水力及其變化的主要指標[8]。與空白對照比較，食鹽單獨使用后蛋白質對不易流動水的束縛強度顯著(p<0.05)下降，不易流動水的流動性顯著增強；而單獨加入磷酸鹽的處理，肌肉蛋白質對不易流動水的束縛能力顯著增強，不易流動水的流動性顯著下降。表明食鹽與磷酸鹽在蛋白質的水合方面發(fā)揮相反的作用，食鹽添加后主要水分的流動性增加，可能水分分布相對均勻；反之，主要水分流動性下降，其活動將可能限定在一定的小范圍內。

對于不同鹽處理的肉糜進行加熱后，只有食鹽與磷酸鹽復合添加處理的自由水含量顯著低于空白處理。在肉糜的斬拌后期加入了一定量的水，而且肉糜加熱之后，4組處理之間自由水含量的差異仍然存在，說明鹽類影響蛋白質的水合溶脹作用，引起水分分布與流動性的差異。蛋白質與許多化學物質之間均存在相互作用，尤其是水、一些鹽類離子和有機溶劑常常很容易引起蛋白質結構的變化，甚至是變性最終影響蛋白質的功能特性[12]。因此，有必要在進行水合特性分析的基礎上繼續(xù)對蛋白質結構變化進行下一步的分析。

2.2 不同鹽處理加熱肉糜傅里葉紅外吸收

如圖3所示，各組加熱后的肉糜紅外光譜形狀與強度沒有明顯差異。由圖4可知，4組處理的二級結構含量變化情況，對于β-折疊結構，食鹽+磷酸鹽組顯著低于其他3個處理，而磷酸鹽組則顯著高于空白與食鹽組，對于α-螺旋結構，磷酸鹽組與空白組差異不大，而食鹽+磷酸鹽組高于食鹽組高于另外2組處理。對于無規(guī)則卷曲食鹽組和磷酸鹽組相比空白組顯著降低，而β-轉角4組之間變化不大。

圖3 不同鹽處理肉糜的紅外吸收光譜Fig.3 FT-IR on the meat batters with different salt treatments

圖4 不同鹽處理肉糜加熱后的蛋白質二級結構Fig.4 Protein secondary structure of different salt trea- tments on the heated meat batters

維持蛋白質二級結構的作用力有多種，α-螺旋與β-折疊主要是依靠氫鍵維持，且不同二級結構的氫鍵強度不同，氫鍵在凝膠形成后維持網(wǎng)絡結構的穩(wěn)定中起到重要作用。水、鹽類離子、有機溶劑或溫度作用于蛋白質，導致蛋白質二級結構變化甚至是變性，都是由于它們改變了蛋白質內部的氫鍵作用[11]。KANG等[22]報道了提高豬肉糜中食鹽添加量，β-折疊含量有升高的趨勢。β-折疊結構是蛋白質集聚和形成凝膠的基礎物質，增加肉制品體系中β-折疊的含量，能夠形成良好的凝膠結構，提高肉制品的硬度和保水性[23-24]。董昳廷等[25]也發(fā)現(xiàn)凝膠的質構、保水性與其蛋白質二級結構含量密切相關。本實驗肉糜在由絞碎到加鹽斬拌再到加水發(fā)生水合，無規(guī)則卷曲含量呈下降趨勢。而張極震等[26]報道了類似的結果，利用FT-IR研究了水對肌紅蛋白和聚賴氨酸溴化氫結合物二級結構的影響，認為提高水合度，就減少了蛋白質無序結構含量，增加了有序二級結構含量。

表1 外光譜酰Ⅰ帶對蛋白質二級結構的波數(shù)[1,27-28]Table 1 Deconvoluted amide I band frequencies andassignments to secondary structure for protein

2.3 相關性分析

加熱肉糜蛋白質的二級結構與水合特性的相關性分析結果如表2所示。

表2 加熱肉糜蛋白質的二級結構與水合特性的相關性分析Table 2 Correlation analysis of heated meat batter proteinsecond structure and hydration states

注：*表示在 0.05 水平(雙側)上顯著相關， **表示在 0.01 水平(雙側)上顯著相關。

對于不同鹽處理加熱后的肉糜，其β-折疊含量與加熱后肉糜的不易流動水T21、自由水弛豫時間T22呈顯著負相關(R=-0.970，p<0.05；R=-0.960，p<0.05)；α-螺旋含量與加熱后肉糜的結合水比例呈顯著負相關(R=-0.971，p<0.05)，與不易流動水比例呈顯著正相關(R=0.980，p<0.05)。即熟肉糜中不易流動水與自由水的流動性越強，加熱后得到的肉糜中的β-折疊含量越低；熟肉糜中結合水比例越高而不易流動水比例越低，則加熱后得到的肉糜中的α-螺旋含量越低。

3 結論

在不同鹽處理的加熱肉糜中，與空白組相比較，食鹽組與食鹽+磷酸鹽組的弛豫時間T2增加，即結合水、不易流動水和自由水的流動性均增加，說明乳化凝膠對3種相態(tài)水分的束縛能力減弱，而磷酸鹽組與之相反；3個處理組(食鹽組、磷酸鹽組、食鹽+磷酸鹽組)均表現(xiàn)出P2b、P22降低而P21增加，即結合水與自由水的含量降低，部分轉化為不易流動水導致其含量升高。在蛋白質二級結構變化中，食鹽單獨加入使得部分無規(guī)則卷曲向α-螺旋轉變，而磷酸鹽的單獨添加使得部分無規(guī)則卷曲向β-折疊轉變；此外，乳化凝膠中不易流動水與自由水的流動性越強，β-折疊含量越低；乳化凝膠中結合水比例越高而不易流動水比例越低，則乳化凝膠中的α-螺旋含量越低。因此，不同鹽處理方式對肉糜凝膠的水合特性產生變化，進而影響肉糜凝膠的蛋白質構象。實際生產過程中，為獲得更優(yōu)質的產品，應考慮不同方式的鹽處理。