馮慧軍，翟磊，于學(xué)健，程坤，劉洋，姚粟

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

大曲高溫放線菌是芽胞桿菌目(Bacillales),高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae),高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)的典型種，由姚粟等人于2014年在芝麻香型白酒高溫大曲中首次發(fā)現(xiàn)[1]，是芝麻香型白酒高溫大曲中的優(yōu)勢菌種，對高溫大曲發(fā)酵及芝麻香型白酒特殊風(fēng)味形成具有不可忽視的作用[2]。高溫大曲發(fā)酵最高品溫達60 ℃以上，大曲高溫放線菌的高溫耐受特征是其在高溫大曲發(fā)酵過程中生長代謝的基礎(chǔ)，深入認識大曲高溫放線菌的耐熱機制不僅有助于掌握其生存特點和規(guī)律，而且有助于解析其在芝麻香型白酒釀造過程中的功能作用，從而有效指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。

脂肪酸是細胞膜的重要組成成分，是影響細胞膜熱穩(wěn)定性的一個重要因素。研究表明，微生物通過增加磷脂酰烷基鏈的長度，增加脂肪酸異構(gòu)化支鏈的比例或增加脂肪酸的飽和度都可提高細胞膜的相變溫度，以維持高溫條件下細胞膜的液晶態(tài)[3-5]。因此，脂肪酸的代謝是影響微生物適應(yīng)外界高溫環(huán)境的一個重要機制。

本文以大曲高溫放線菌模式菌株CICC 10681為研究對象，利用RNA-seq技術(shù)結(jié)合氣相色譜研究了大曲高溫放線菌CICC 10681在不同溫度下參與脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達情況及脂肪酸含量變化，旨在從分子層面及表型層面解析脂肪酸代謝對大曲高溫放線菌CICC 10681耐熱性能的影響，為大曲高溫放線菌在芝麻香型白酒釀造過程中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

大曲高溫放線菌CICC 10681分離自高溫大曲，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。R2A液體生長培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨1.5，酸水解酪蛋白3，酵母浸粉3，可溶性淀粉3，K2HPO41.8，MgSO40.6，丙酮酸鈉1.8，蛋白胨1.5，葡萄糖10，pH 7，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 主要試劑及設(shè)備

TRizol試劑：Invitrongen公司；PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBRPremix Ex TaqII試劑盒：TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；NaOH、NaCl、甲酸和濃HCl(分析純)：北京化工廠；正己烷(色譜純)：西隴化工股份有限公司；甲基叔丁醚(色譜純)：天津市光復(fù)精細化工研究所。

恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；低溫離心機，德國Eppendorf公司；HP6890氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司，配備分流/不分流進樣口，氫火焰離子化檢測器(FID)及HP氣相層析化學(xué)工作站，層析柱為Ultra-2柱，長25 m，內(nèi)徑0.2 mm，液膜厚度0.33 μm。

1.3 方法

1.3.1 菌體收集

從甘油管轉(zhuǎn)接大曲高溫放線菌CICC 10681菌體于R2A液體生長培養(yǎng)基中，55 ℃條件下180 r/min培養(yǎng)過夜，制備成種子液。將種子液在OD620下的吸光值調(diào)至0.5，按2%接種量接種至新的R2A液體生長培養(yǎng)基中。在pH 7.0條件下，分別于45、55和60 ℃下，180 r/min振蕩培養(yǎng)，取對數(shù)生長期菌懸液(OD620為0.5)，12 000 r/min離心1 min收集菌體。不同溫度下收集的菌體分別記為S45、S55和S60，-20 ℃保存供后續(xù)分析使用。

1.3.2 RNA測序確定脂肪酸代謝基因差異表達

參照TRizol試劑使用說明書提取總RNA，采用Agilent 2100 Bioanalyzer和Nanodrop 2000超微量分光光度計對總RNA的純度、濃度及完整性進行質(zhì)控，需保證RNA的OD260/280在1.8～2.2之間，RNA完整性(RIN值)在8以上，質(zhì)控合格后利用BGISEQ-500測序儀測序。

對高通量測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進行質(zhì)控，去除接頭污染序列、無意義序列(N的含量大于10%)及低質(zhì)量序列(Q值≤5的堿基數(shù)占序列總長度的50%以上)，得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)[6]。使用Biwtie2軟件將有效數(shù)據(jù)比對到大曲高溫放線菌CICC 10681參考基因組序列中[7-8]。基因表達定量使用RSEM工具完成，定量結(jié)果以FPKM(Reads Per Kilobases per Million reads)表示[9]。根據(jù)基因表達量(FPKM值)，計算各基因在不同樣本間的差異表達倍數(shù)。通過控制錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)對P-value值進行校正，定義FDR≤0.001且差異倍數(shù)大于2倍為差異表達基因。

1.3.3 實時熒光定量PCR

參照PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書操作步驟，去除RNA樣品中DNA污染并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為實時熒光定量PCR反應(yīng)(quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)的模板。利用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System，參照SYBRPremix Ex TaqII試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)液體系，使用兩步法擴增程序(預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán))進行反應(yīng)。采用primer 5.0軟件設(shè)計反應(yīng)引物，以16S rRNA作為內(nèi)參基因，目標驗證基因的引物如表1所示，使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達差異倍數(shù)[10]。

表1 實時熒光定量PCR驗證大曲高溫放線菌CICC 10681脂肪酸代謝相關(guān)基因及引物Table 1 The genes and primers of fatty acid metabolism in Thermoactinomyces daqus CICC 10681 used for RT-qPCR

1.3.4 脂肪酸組分測定

脂肪酸提取參考《放線菌系統(tǒng)學(xué)—原理、方法及實踐》中描述方法，大致分為皂化、甲基化、提取、堿洗4個步驟[11]。脂肪酸測定采用氣相色譜法結(jié)合美國MIDI公司Sherolock全自動細菌鑒定系統(tǒng)的標準化分析結(jié)果，氣相色譜條件為：爐溫為二階程序升溫，起始溫度170 ℃，以5 ℃/min的上升速度升至260 ℃，隨后以40 ℃/min升至310 ℃，維持1.5 min；進樣口溫度250 ℃，載氣為H2，流速0.5 mL/min，分流進樣模式，分流比100∶1，進樣量2 μL；檢測器溫度300 ℃，H2流速30 mL/min，空氣流速216 mL/min，補充氣(N2)流速30 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度大曲高溫放線菌脂肪酸代謝相關(guān)基因差異表達情況

大曲高溫放線菌CICC 10681與脂肪酸代謝相關(guān)基因組成及在不同溫度下的差異表達如表2所示。與45 ℃相比，大曲高溫放線菌CICC 10681在55和60 ℃時生物素羧基載體蛋白編碼基因accB分別上調(diào)表達8.6和11.3倍，生物素羧化酶編碼基因accC分別上調(diào)表達4.6和5.3倍，丙二酰輔酶A: ACP轉(zhuǎn)移酶編碼基因fabD分別上調(diào)表達8.6和8.9倍，β-酮脂酰-ACP合成酶III編碼基因fabH分別上調(diào)表達6.5和7.1倍，β-酮脂酰-ACP合成酶II編碼基因fabF分別上調(diào)表達6.5和9.2倍，β-酮脂酰-ACP還原酶編碼基因fabG分別上調(diào)表達8.6和9.2倍，β-羥脂酰-ACP脫水酶編碼基因fabZ分別上調(diào)表達8.6和9.2倍，烯脂酰-ACP還原酶編碼基因fabV分別上調(diào)表達6.5和7.0倍。大曲高溫放線菌CICC 10681中與脂肪酸合成相關(guān)的11個基因中，8個基因在不同溫度下發(fā)生了差異表達，與45 ℃相比，在55和60 ℃時平均上調(diào)表達7.3和8.4倍。說明隨著溫度升高，大曲高溫放線菌CICC 10681增強了脂肪酸合成途徑。

表2 不同溫度下大曲高溫放線菌CICC 10681脂肪酸代謝相關(guān)基因表達情況Table 2 The differentially expressed genes related fatty acid metabolism inThermoactinomyces daqus CICC 10681 at different temperatures

注：“/”表示未發(fā)生差異表達

與45 ℃相比，大曲高溫放線菌CICC 10681在55和60 ℃時脂酰輔酶A合酶編碼基因fadD分別下調(diào)表達7.5和7.8倍，脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因acdA分別下調(diào)表達8.0和8.0倍，烯脂酰輔酶A水合酶編碼基因echA分別下調(diào)表達7.5和7.6倍，脂酰輔酶A轉(zhuǎn)酰酶編碼基因fadA分別下調(diào)表達6.1和6.9倍。大曲高溫放線菌CICC 10681中與脂肪酸分解相關(guān)的4個基因全部發(fā)生了差異表達，與45 ℃相比，在55和60 ℃時分別平均下調(diào)表達7.3和7.6倍。說明隨著溫度升高，大曲高溫放線菌CICC 10681減弱了脂肪酸分解途徑。

乙酰-CoA是直鏈脂肪酸從頭合成的原材料，其主要通過丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體代謝產(chǎn)生[12]。與45 ℃相比，大曲高溫放線菌CICC 10681在55和60 ℃時丙酮酸脫氫酶復(fù)合體編碼基因pdhA、pdhB、pdhC和pdhD分別平均上調(diào)表達2.7和3.1倍。與直鏈脂肪酸不同，在支鏈脂肪酸的合成時乙酰輔酶A被分別由亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸經(jīng)支鏈酮酸脫水酶復(fù)合體代謝產(chǎn)生的異戊酰CoA(Isovaleryl-CoA)、異丁酰CoA(Isobutyryl-CoA)和2-甲基丁酰CoA(2-methylbutyryl-CoA)代替[13]。與45 ℃相比，大曲高溫放線菌CICC 10681在55和60 ℃時支鏈酮酸脫水酶復(fù)合體編碼基因ilvE、ilvB和ilvD分別平均下調(diào)表達5.3和6.0倍(表3)。

表3 不同溫度下大曲高溫放線菌CICC 10681纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸分解相關(guān)基因表達情況Table 3 The differentially expressed genes related valine，leucine and isoleucine synthesis inThermoactinomyces daqus CICC 10681 at different temperatures

注：“/”表示未發(fā)生差異表達。

綜上，隨著溫度升高，大曲高溫放線菌CICC 10681中直鏈脂肪酸合成通路呈上調(diào)趨勢。同時，在大曲高溫放線菌CICC 10681中未發(fā)現(xiàn)與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的β-羥脂酰-ACP脫水酶FabA和β-酮脂酰-ACP縮合酶FabB。說明在高溫條件下大曲高溫放線菌CICC 10681增強了直鏈飽和脂肪酸的合成。

2.2 實時熒光定量PCR驗證分析

實時熒光定量PCR結(jié)果表明(圖1)，與45 ℃相比，大曲高溫放線菌CICC 10681在55、60 ℃時乙酰輔酶A羧化酶編碼基因accB分別上調(diào)表達8.4和10.3倍，丙二酰輔酶A: ACP轉(zhuǎn)移酶編碼基因fabD分別上調(diào)表達7.9和9.4倍，β-酮脂酰-ACP合成酶II編碼基因fabF分別上調(diào)表達6.5和8.3倍。脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因acdA分別下調(diào)表達7.1和7.7倍，脂酰輔酶A轉(zhuǎn)酰酶編碼基因fadA分別下調(diào)表達7.9和7.5倍。實時熒光定量PCR驗證結(jié)果與RNA-seq分析結(jié)果基本保持一致。

圖1 不同溫度大曲高溫放線菌CICC 10681脂肪酸代謝相關(guān)基因的實時熒光定量PCR驗證結(jié)果Fig.1 RT-qPCR verification results for genes related fattyacid metabolism in Thermoactinomyces daqus CICC 10681 at different temperatures

2.3 溫度變化對大曲高溫放線菌脂肪酸組成及含量的影響

大曲高溫放線菌CICC 10681在不同溫度下脂肪酸組成及含量測定結(jié)果表明(表4)，大曲高溫放線菌CICC 10681的脂肪酸主要以直鏈飽和脂肪酸(C16∶0、C18∶0)和單甲基支鏈飽和脂肪酸(iso-C15∶0、anteiso-C15∶0、iso-C16∶0、iso-C17∶0、anteiso-C17∶0)為主，且相同碳鏈長度脂肪酸(C15∶0和C17∶0)中，iso式脂肪酸含量高于anteiso式脂肪酸含量。隨著溫度升高，支鏈飽和脂肪酸含量均呈下降趨勢，直鏈飽和脂肪酸含量呈上升趨勢，與45 ℃相比，大曲高溫放線菌CICC 10681在60 ℃培養(yǎng)時，C16∶0的含量由8.99%上升到14.45%，升高了1.6倍，C18∶0的含量由1.38 %上升到12.73 %，升高了近10倍。

表4 不同溫度大曲高溫放線菌CICC 10681的脂肪酸組成Table 4 Fatty acid composition of Thermoactinomycesdaqus CICC 10681 at different temperatures

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差

3 討論

液晶態(tài)是細胞膜發(fā)揮保護作用、選擇性吸收、信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換等功能的物化性質(zhì)基礎(chǔ)。所謂液晶態(tài)是指某些有機化合物在發(fā)生固相到液相轉(zhuǎn)變時的過渡狀態(tài)，既具有液態(tài)的流動性、黏度、變形等特性，同時也具有固態(tài)晶體的有序性。能形成液晶態(tài)的有機化合物一般為長棒狀或平板狀，具有一定的剛性，還有極強的偶極矩和容易極化的基團[14-15]。而構(gòu)成生物膜的各種磷脂分子也都具有上述特點。因此，微生物通過調(diào)節(jié)磷脂分子的相變溫度來維持不同溫度下細胞膜的液晶態(tài)是其適應(yīng)外界環(huán)境溫度變化的一個重要機制[17]。

通常磷脂分子的相變溫度與結(jié)合在該磷脂上的脂肪酸熔點相同[18]。不同種類的脂肪酸具有不同的熔點，總體趨勢為碳氫鏈越短，越不飽和，則熔點越低，相同碳鏈的支鏈脂肪中，iso式脂肪酸的熔點要明顯高于anteiso式脂肪酸[19]。大曲高溫放線菌CICC 10681的脂肪酸主要以飽和脂肪酸為主，而無不飽和脂肪酸，這可能與大曲高溫放線菌不含有與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的FabA和FabB 2個酶相關(guān)。而且相同碳鏈長度脂肪酸(C15∶0和C17∶0)中，iso式脂肪酸含量高于anteiso式脂肪酸含量，說明大曲高溫放線菌CICC 10681的脂肪酸相對主要以高熔點脂肪酸為主，高熔點的脂肪酸使其細胞膜具有較高的相變溫度，這在一定程度上與大曲高溫放線菌CICC 10681的嗜高溫特性是吻合的。

需要強調(diào)的是，相同碳原子的直鏈脂肪酸與iso式脂肪酸的熔點大致相同，但直鏈脂肪酸構(gòu)成的磷脂分子的相變溫度要明顯高于iso式脂肪酸構(gòu)成的磷脂分子的相變溫度。這種差異與不同脂肪酸在磷脂分子的結(jié)合位點不同相關(guān)。如在枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)中，n-C15脂肪酸主要結(jié)合在磷脂分子的1號位置，anteiso-C15脂肪酸主要結(jié)合在磷脂分子的2號位置，Iso-C15脂肪酸則主要結(jié)合在磷脂分子的1號和2號位置之間[20]?？梢钥闯?，溫度升高條件下大曲高溫放線菌CICC 10681增強了直鏈飽和脂肪酸的含量，降低了支鏈飽和脂肪酸的含量。這2種脂肪酸含量的變化可能都是大曲高溫放線菌CICC 10681在高溫條件下提高其細胞膜相變溫度以維持細胞膜流動性的有效調(diào)控方式。

4 結(jié)論

本研究利用RNA-seq技術(shù)結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)在分子水平研究了不同溫度下大曲高溫放線菌CICC 10681脂肪酸代謝相關(guān)基因的差異表達，并通過氣相色譜結(jié)合Sherolock全自動細菌鑒定系統(tǒng)在表型水平研究了不同溫度下大曲高溫放線菌CICC 10681脂肪酸的組成及變化。結(jié)果表明，溫度升高條件下，大曲高溫放線菌CICC 10681增強了直鏈飽和脂肪酸的合成，減弱了支鏈飽和脂肪酸的合成，脂肪酸種類及含量變化呈現(xiàn)出提高細胞膜相變溫度的變化趨勢，這種變化趨勢保證了大曲高溫放線菌CICC 10681在高溫條件下細胞膜功能的正常發(fā)揮，是其適應(yīng)高溫環(huán)境的一個重要機制。