劉歡，謝婷，何美珊，丁楠，鐘青萍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642)

副溶血弧菌是一種常見的嗜鹽性革蘭氏陰性菌，適宜生長2.5%～3%的鹽溶液中，主要分布于海水及魚、蝦、蟹、貝等海產(chǎn)食品中，是引起海鮮類食物中毒的主要原因[1-3]。據(jù)報道，在亞洲，尤其是在中國、日本、韓國，因?yàn)樯院ｕr而引起的副溶血弧菌食物中毒事件頻頻發(fā)生[4-5]。2003-2005年廣東省水產(chǎn)品污染狀況調(diào)查顯示，431份樣品中有156份檢出副溶血性弧菌，總檢出率為36.19%[6]。2008年上海的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，副溶血弧菌是導(dǎo)致夏秋季腹瀉的主因，門診腹瀉患者肛拭檢測副溶血性弧菌陽性率為2.95%，遠(yuǎn)高于沙門菌(0.53%)，位居首位[7]。2016年唐山市調(diào)查顯示，采集的204份海產(chǎn)品中，副溶血性弧菌陽性檢出率為32.84%[8]。副溶血弧菌攜帶tdh、trh毒力基因，人感染后會導(dǎo)致急性腸胃炎，臨床癥狀為腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、低燒[9]。

由于抗生素的長期、不合理使用以及缺乏有效監(jiān)管，病原菌的耐藥性越來越強(qiáng)，且出現(xiàn)多重耐藥性問題。近年來，多種“超級細(xì)菌”不斷被發(fā)現(xiàn)，引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[10]。2010年8月《柳葉刀》報道了英國卡迪夫大學(xué)醫(yī)學(xué)院蒂莫西教授發(fā)現(xiàn)的攜帶新德里一號金屬酶(NDM-1)基因的細(xì)菌，這是繼MRSA之后發(fā)現(xiàn)的又一超級耐藥細(xì)菌[11]。耐藥感染性疾病已成為當(dāng)前臨床感染性疾病死亡的主要原因[12]。海產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的濫用也導(dǎo)致了副溶血弧菌耐藥性的增強(qiáng)，使得抗生素的藥敏性大大下降甚至消失，從而導(dǎo)致臨床治療副溶血弧菌感染病癥難度變大，成本增加。

生物膜(biofilm)是單一或混合的微生物聚集、附著于物體表面上生長繁殖，并包被在自身分泌的胞外聚合物中而形成的類膜結(jié)構(gòu)的聚合體[13-14]。生物膜能夠使細(xì)菌免受宿主的獲得性免疫應(yīng)答以及吞噬細(xì)胞的捕食，使其耐藥性提高10～1 000倍[15]。本研究對廣州市售海產(chǎn)品中的副溶血弧菌進(jìn)行分離鑒定，并分析了其耐藥性及生物膜形成能力，旨在為海產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制以及防治副溶血弧菌感染提供理論依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株與材料

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC 17802、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922由本實(shí)驗(yàn)室保藏。魚、蝦、蛤、蠔等海產(chǎn)品采集于廣州市區(qū)超市及農(nóng)貿(mào)市場。氧化酶試紙、副溶血弧菌生化檢測試劑盒購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 藥敏紙片

20種常用抗生素的藥敏檢測紙片，包括青霉素(PEN,10 μg)、氨芐西林(AMP,10 μg)、氨芐西林/舒巴坦(AMS,10 μg)、美羅培南(MEM,10 μg)、多粘菌素B(PB,300 μg)、萬古霉素(VAN,30 μg)、頭孢噻吩(CEP,30 μg)、頭孢他啶(CAZ,30 μg)、慶大霉素(GEN,10 μg)、卡那霉素(KAN,30 μg)、鏈霉素(STR,10 μg)、四環(huán)素(TET,30 μg)、強(qiáng)力霉素(DOX,30 μg)、氯霉素(CHL,30 μg)、乙酰螺旋霉素(ASP,30 μg)、紅霉素(ERY,15 μg)、環(huán)丙沙星(CIP,5 μg)、萘啶酸(NA,30 μg)、利福平(RIF,5 μg)、復(fù)方新諾明(SXT,23.75/1.25 μg)，購于杭州市微生物試劑有限公司。

1.1.3 溶液及培養(yǎng)基

質(zhì)量濃度為1 g/L結(jié)晶紫溶液;體積分?jǐn)?shù)為33%冰乙酸溶液：量取100 mL冰乙酸，加入到200 mL去離子水中。

含質(zhì)量濃度為30 g/L NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、NaCl 30 g、去離子水1 L。用1 mol /L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為7.0～7.4; 121 ℃，0.15 MPa下高壓滅菌15 min。

含30 g/L NaCl 的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基(TSA)：在上述TSB 配方的基礎(chǔ)上加入1.5% 的瓊脂，加熱融化后滅菌。

含30 g/L NaCl的堿性蛋白胨水、TCBS培養(yǎng)基、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、MR-VP培養(yǎng)基、MHB培養(yǎng)基均購于廣東環(huán)凱微生物微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理

從廣州市各區(qū)的14個超市及農(nóng)貿(mào)市場采集市售的魚、蝦、蛤、蠔等海產(chǎn)品，用無菌采樣袋裝好后放入冰盒裝中返校，確保在2 h內(nèi)處理樣品。魚取表面組織、腮、腸；蝦(甲殼類)用自來水洗凈后取整個動物，包括腸和腮；蛤和蠔(貝類)用自來水沖洗干凈后取內(nèi)容物。取樣時均為無菌操作方式。

1.2.2 副溶血弧菌的分離鑒定

菌株分離鑒定：按照GB 4789.7—2013中副溶血弧菌檢驗(yàn)方法，樣品在質(zhì)量濃度為30 g/L氯化鈉堿性蛋白胨水中增菌后，劃線分離于TCBS平板中，挑取可疑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂試驗(yàn)、嗜鹽性試驗(yàn),并利用副溶血弧菌生化檢測試劑盒進(jìn)行生化鑒定，包括30 g/L氯化鈉甘露醇、3%氯化鈉賴氨酸脫羧酶、ONPG和MR-VP試驗(yàn)。

16S rDNA測序：生化試驗(yàn)陽性菌株進(jìn)行16S rDNA同源性比較分析。菌株在TSB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，于-20 ℃中保存?zhèn)溆??；蚪MDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和1495R： 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。擴(kuò)增體系為：無菌水10.5 μL，混合引物1 μL，taqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL。其中混合引物為1 μL 27f、1 μL 1492r和8 μL無菌水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min(95 ℃變性1 min，54 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min)，30個循環(huán)，72 ℃保溫10 min。擴(kuò)增后的DNA經(jīng)檢驗(yàn)送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。將16S rDNA 基因測序結(jié)果通過BLAST在GenBank中進(jìn)行同源比對分析。

1.2.3 菌株的耐藥性分析

將副溶血弧菌分離菌株、ATCC 17802菌株和質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922分別接種于TSB和LB培養(yǎng)基中，于120 r/min的搖床內(nèi)37 ℃活化12 h。培養(yǎng)液于4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水10倍稀釋至濃度為108CFU/mL。

取100 μL菌液在MH瓊脂平板中，涂布均勻。干燥數(shù)分鐘后，用無菌鑷子夾取20種常用抗生素紙片輕輕放置在平板中，紙片間距不小于24 mm，距離平板邊緣不小于15 mm。平行實(shí)驗(yàn)3次。將平板倒置于培養(yǎng)箱中，37 ℃下培養(yǎng)18 h后，用標(biāo)準(zhǔn)直尺測量抑菌圈大小，根據(jù)參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)推薦的紙片擴(kuò)散法及判定標(biāo)準(zhǔn)[16]、杭州微生物試劑有限公司提供的產(chǎn)品說明書整理出的標(biāo)準(zhǔn)(表1)判定結(jié)果。

1.2.4 結(jié)晶紫染色法測定生物膜形成量

將副溶血弧菌TSB培養(yǎng)液離心后收集菌體用TSB培養(yǎng)基10倍稀釋至濃度為106CFU/mL；分別在96孔板中每孔加入200 μL菌液；封蓋后用保鮮膜包好，在37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h；將孔板中的培養(yǎng)液去除，使用多道移液槍在每孔中加入250 μL無菌生理鹽水清洗3遍，去除浮游菌； 60 ℃干燥15 min；在干燥后的孔板中加入200 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的結(jié)晶紫溶液，染色10 min；棄去結(jié)晶紫溶液，使用無菌生理鹽水清洗3遍，繼續(xù)干燥15 min；在每孔中加入200 μL、33%冰乙酸，靜置10 min后，使用Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo, USA)測量OD595值[17]。

表1 副溶血弧菌對20種抗生素的耐藥標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus against 20 antibiotics

注： R為耐藥；I為中介敏感；S為敏感。a為尚未在CLSI標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)中找到的判定標(biāo)準(zhǔn)，是本實(shí)驗(yàn)室暫定的判定值。下同。

2 結(jié)果與分析

2.1 海產(chǎn)中副溶血弧菌的分離鑒定

從廣州市區(qū)的超市及農(nóng)貿(mào)市場采集市售海產(chǎn)品，隨即進(jìn)行樣品處理，增菌18 h后進(jìn)行TCBS平板劃線分離、革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)、質(zhì)量濃度為30 g/L的氯化鈉三糖鐵試驗(yàn)、嗜鹽性試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離菌株在TCBS培養(yǎng)基中菌落為綠色(圖1)，鏡檢為短弧狀的桿菌(圖2)。

圖1 副溶血弧菌在TCBS、TSA平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Vibrio parahaemolyticus on TCBS and TSA plates

圖2 副溶血弧菌分離菌株掃描電鏡圖Fig.2 SEM picture of the isolated strain of Vibrioparahaemolyticus

氧化酶試驗(yàn)呈陽性，具有嗜鹽性。對8株菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA同源性比較，鑒定為副溶血弧菌菌株(表2)。

2.2 分離菌株的耐藥性分析

測定副溶血弧菌分離菌株和ATCC 17802菌株對常用20種抗生素的藥敏結(jié)果如表3、圖3所示。結(jié)果表明，8株分離菌株對青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、青霉烯類的抗生素抗性很強(qiáng)，對氨基糖苷類、四環(huán)素類、苯丙醇類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、安莎霉素類、葉酸代謝途徑抑制劑等抗生素較為敏感。其中對青霉素、萬古霉素2種抗生素均顯示耐藥性；對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩耐藥的菌株也達(dá)到7株，對美羅培南、利福平耐藥的菌株分別有6株和5株。而對多粘菌素B、頭孢他啶、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、萘啶酸等抗生素均敏感，對卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明具有耐藥性的菌株比較少，有1～2株，說明這些抗生素表現(xiàn)出對副溶血弧菌分離菌株較強(qiáng)的抑制作用。此外，只有8號菌株的耐藥性弱于ATCC 17802菌株，大部分分離菌株耐抗生素的種類更多。

表2 分離菌株16S rDNA同源性比對分析Table 2 16S rDNA sequence analysis of the isolated strains of Vibrio parahaemolyticus

表3 分離菌株的耐藥性測定Table 3 Drug resistances of the isolated strains ofVibrio parahaemolyticus

圖3 不同抗生素的耐藥性菌株數(shù)量分析Fig.3 The numbers of the resistant strains against different antibiotics

2.3 菌株的多重耐藥性分析

通過分析發(fā)現(xiàn)，所有菌株都存在多重耐藥性，且耐抗生素種類都在3～10種，多重耐藥性主要發(fā)生于青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、青霉烯類之間(圖4)。由此可見副溶血弧菌分離菌株多重耐藥性很強(qiáng)。同時，ATCC 17802菌株也具有多重耐藥性，耐抗生素種類為5種。其中來源于鱸魚、蝦體內(nèi)的分離菌株多重耐藥性很強(qiáng)，2號菌株耐藥性最強(qiáng)，耐抗生素種類高達(dá)10種，1、4、5、7號菌株耐抗生素8種以上，均比ATCC 17802菌株多。僅有來源于蛤的8號菌株耐3種抗生素，多重耐藥性相對ATCC 17802菌株較弱。在對多重耐藥譜分析中發(fā)現(xiàn)，來源于蝦體內(nèi)的4、5號菌株耐抗生素都是8種，且兩者只有1種抗生素差別；來源于魚的1、2、6、7號菌株的多重耐藥無論數(shù)量還是種數(shù)差異都比較大(表4)。

圖4 副溶血弧菌分離菌株的多重耐藥性分析Fig.4 Multi-drug resistances of the isolated strains of Vibrioparahaemolyticus

2.4 副溶血弧菌生物膜形成能力分析

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和8株分離菌株的生物膜形成能力如圖5所示。所有菌株都具有一定的生物膜形成能力，但生物膜形成量有一定的差異。其中1、2、3、4、5、7號菌株形成生物膜的能力比較強(qiáng)，尤其是1、2、3、4號菌株；6、8號菌株生物膜成膜能力較弱。僅有8號菌株的生物膜形成能力弱于標(biāo)準(zhǔn)菌株。

表4 副溶血弧菌分離菌株的多重耐藥譜Table 4 Multidrug resistance spectrum of Vibrioparahaemolyticus strains

圖5 副溶血弧菌生物膜形成能力Fig.5 The biofilm formation ability of Vibrio parahaemoly-ticus strains注：**表示與ATCC 17802菌株對比有極顯著差異(p<0.01)。*表示與ATCC 17802有顯著差異(p<0.05)，沒有標(biāo)識為無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

3.1 菌株耐藥性差異分析

副溶血弧菌耐藥性具有時空特性，不同地區(qū)的菌株具有不同的耐藥性。這是由于每個地區(qū)使用抗生素種類、劑量和菌群特異性導(dǎo)致的。本研究的結(jié)果表明，市售海產(chǎn)品中8株副溶血弧菌分離菌株對青霉素、萬古霉素2種抗生素顯示完全耐藥；對美羅培南、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩、利福平這5種抗生素具有非常普遍的耐藥性，耐藥菌株在5株以上；對卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明5種抗生素耐藥性很低，對多粘菌素B、頭孢他啶、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、萘啶酸等抗生素均敏感。同為廣州市海產(chǎn)品中副溶血弧菌分離菌株，冼鈺茵等[18]的研究表明，其對萬古霉素、氨芐西林、鏈霉素的耐藥率分別為100%、77.01%和85.06%，對利福平、慶大霉素、紅霉素、頭孢噻吩、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星的耐藥率在5%及以下。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有比較高的一致性，但又在頭孢噻吩、利福平這2種抗生素上存在區(qū)別。說明同地區(qū)的副溶血弧菌耐藥性也不盡相同。而由于不同地區(qū)抗生素使用數(shù)量和劑量的差別、菌群差別，在國內(nèi)的其他地區(qū)或國外地區(qū)，副溶血弧菌耐藥性差異更大。盧奕等[19]研究表明，上海市水產(chǎn)品中副溶血弧菌對卡那霉素、多粘菌素B、環(huán)丙沙星的耐藥性很高，對氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻吩、萬古霉素、利福平的耐藥性非常低，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不同。

分離菌株對同一類抗生素的耐藥性不同。如萬古霉素和多粘菌素B都是糖肽類抗生素，頭孢噻吩和頭孢他啶都是頭孢類抗生素，由于前者是第一代藥物，后者是第三代藥物，副溶血弧菌對前者耐藥性明顯比后者強(qiáng)。不同來源的副溶血弧菌菌株的耐藥性也不同，本研究發(fā)現(xiàn)，來源于魚和蝦的7株菌多重耐藥性強(qiáng)，耐抗生素種類為5～10種。相比較而言，來源于蛤的8號菌株，多重耐藥性較弱，耐抗生素為3種。

3.2 細(xì)菌生物膜與耐藥性

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌生存的一種重要機(jī)制，它增強(qiáng)了細(xì)菌對不良環(huán)境的耐受力，尤其是耐藥性。生物膜阻礙隔絕抗生素的進(jìn)入，同時為膜內(nèi)細(xì)胞的生存及相互交流提供穩(wěn)定環(huán)境[20-21]。同時，生物膜外排泵系統(tǒng)[22]、特定基因變化引起的應(yīng)激反應(yīng)[23]、群體感應(yīng)[24]、膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性下降[25]也是其耐藥機(jī)制。本研究分析副溶血弧菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其生物膜形成能力發(fā)現(xiàn)，兩者之間存在正相關(guān)。其中，1、2、3、4、5、7號菌株生物膜形成能力比較強(qiáng)，其多重耐藥性也非常顯著，耐抗生素種類為7～10種；6號和8號菌株生物膜形成能力比較差，耐抗生素種類分別為5種和3種。與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802相比，6號和8號菌株在形成生物膜能力差異相對小，其多重耐藥性的差異也不大，而其他菌株生物膜形成能力極顯著(p<0.01)強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，其多重耐藥性也十分顯著。有研究表明生物膜細(xì)菌對次氯酸的抗性比浮游菌強(qiáng)15～3 000倍[26]，致病性大腸桿菌對環(huán)丙沙星及氟苯尼考的耐藥性與生物膜形成能力呈正相關(guān)[27]。

3.3 副溶血弧菌耐藥機(jī)制

副溶血弧菌作為常見的食源性致病菌，威脅著人類的健康，其耐藥性一直受到國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。已有研究表明，副溶血弧菌耐藥機(jī)制主要有：(1)可移動基因元件。質(zhì)粒介導(dǎo)的獲得耐藥基因盒的整合子能夠在細(xì)菌間直接進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移。已有研究表明，副溶血弧菌存在質(zhì)粒介導(dǎo)的Blaper-1、Blacmy-2、Blaveb-1 3種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)，能夠破壞抗生素，尤其是頭孢類抗生素[28-30]。(2)藥物作用靶位改變。革蘭氏陰性菌在β-內(nèi)酰胺類抗生素作用下，其青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)發(fā)生突變而導(dǎo)致與抗生素親和力發(fā)生改變產(chǎn)生耐藥性。(3)細(xì)胞膜滲透性改變。由于一些細(xì)菌細(xì)胞膜的膜孔蛋白少、通道小，導(dǎo)致抗生素(如β-內(nèi)酰胺類)很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這是細(xì)菌的“固有耐藥性[31]。(4)外排機(jī)制是細(xì)菌形成耐藥性及多重耐藥性的重要因素。副溶血弧菌的外排泵主要有Vmr A、Nor M和Vme AB，其能夠?qū)⒋蠓肿游镔|(zhì)排出細(xì)胞外，幫助其產(chǎn)生多重耐藥性[31-32]。本研究通過對市售海產(chǎn)品中副溶血弧菌的耐藥性及其生物膜形成能力的分析，可以為后續(xù)的副溶血弧菌耐藥性的深入研究提供參考資料，也為海產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制、防治副溶血弧菌感染提供理論依據(jù)，具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。