張歡歡，陳昶旭，劉中美，周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

羧肽酶是一類水解多肽鏈的羧基端氨基酸殘基的外肽酶，在細(xì)菌、真菌、植物和動物中均有發(fā)現(xiàn)[1-2]。按其活性中心的特點可以分成絲氨酸羧肽酶、天冬氨酸羧肽酶以及半胱氨酸羧肽酶。羧肽酶Y是一種絲氨酸羧肽酶，它的活性中心由絲氨酸、天冬氨酸和組氨酸(Ser-Asp-His)組成[3]。羧肽酶Y不僅底物廣泛，而且具有其他羧肽酶不具備的從多肽鏈羧基端降解脯氨酸殘基的能力[4]。因此，它在多肽氨基酸分析和食品脫苦方面有著廣泛的應(yīng)用[5-6]。目前研究較多的羧肽酶Y來源于釀酒酵母[1]，而對其他物種，特別是絲狀真菌來源的羧肽酶Y的研究相對較少。

雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)應(yīng)用于中國傳統(tǒng)食品腐乳的制作過程中，經(jīng)長期高蛋白環(huán)境的馴化，具有了強大胞外蛋白分泌能力。在腐乳發(fā)酵過程中，其豐富的胞外蛋白酶系將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成短肽和氨基酸[7]。大豆蛋白的水解物常常具有苦味，有研究發(fā)現(xiàn)，雅致放射毛霉中的羧肽酶可以應(yīng)用于大豆蛋白水解物的脫苦[7-8]。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、能夠進(jìn)行高密度發(fā)酵、沒有內(nèi)毒素、能夠進(jìn)行翻譯后修飾等諸多優(yōu)點[9]，使其廣泛應(yīng)用于來源真核基因的異源表達(dá)。外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量受到多種因素的影響，如信號肽、啟動子、外源基因的拷貝數(shù)以及外源蛋白的分泌途徑等[10-13]。有研究者通過提高抗生素濃度的篩選方法[14]，篩選得到不同拷貝數(shù)的重組菌株，從中得到高效表達(dá)菌株，實現(xiàn)了外源蛋白的高效分泌表達(dá)，還有研究者通過在重組菌中共表達(dá)分泌促進(jìn)因子binding protein(BIP)、protein disulfide isomerase (PDI)、endoplasmic oxidoreductin 1(ERO1)，將蛋白的分泌量提升到原來的1.9倍、2.2倍和2.3倍[15]。

前期研究中，在雅致放射毛霉的基因組中克隆了一種屬于羧肽酶Y家族新型的蛋白酶的基因，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，在畢赤酵母GS115中進(jìn)行異源表達(dá)[17]。本研究構(gòu)建含有不同啟動子的重組菌，通過提高抗生素濃度的篩選方法，獲得高效分泌表達(dá)菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

EscherichiacoliJM109購自Novagen公司；表達(dá)宿主PichiaPastorisGS115、質(zhì)粒pPICZα、pGAPZα購自美國Invitrogen公司；ActinomucorelegansPEP001由本實驗室保存；pPIC9K-proCPY質(zhì)粒由安徽通用生物公司合成；pGAPZ-BIP、pGAPZ-PDI、pGAPZ-ERO1由江南大學(xué)金堅教授饋贈。

大腸桿菌生長培養(yǎng)基為low salt(LB)培養(yǎng)基:溶解5 g酵母提取物，10 g蛋白胨，5 g NaCl于900 mL水中，完全溶解后定容到1 L(配置固體培養(yǎng)基時加入 20 g/L瓊脂粉)；畢赤酵母菌株生長培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基；表達(dá)培養(yǎng)基為BMGY和BMMY，兩者均按照Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)手冊配制。

1.2 試劑與儀器

N-芐氧羰?；?L-苯丙氨酸-L-酪氨酸(CBZ-Phe-Tyr)購自上海Peptides International公司；T4連接酶、高保真DNA聚合酶Prime Star、限制性內(nèi)切酶EcoR I、NotI、SacI、DpnI均購自日本寶生物工程有限公司；蛋白酶K購自上海生物工程公司；其他試劑均為常用分析純試劑。

1.3 表達(dá)載體pPICZα-proCPY的構(gòu)建

從本實驗室保存的菌株ActinomucorelegansPEP001中反轉(zhuǎn)錄得到羧肽酶Y的基因[16]，對反轉(zhuǎn)錄得到的基因密碼子優(yōu)化之后由安徽通用生物公司進(jìn)行基因合成。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和NotI從合成質(zhì)粒pPIC9K-proCPY上將CPY基因切下，通過雙酶切連接的方式連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂布于含有25 μg/mL的Low Salt LB培養(yǎng)基平板篩選轉(zhuǎn)化子。

1.4 重組菌株pPICZα-proCPY/GS115的篩選及表達(dá)

將測序正確的質(zhì)粒pPICZα-proCPY用限制性內(nèi)切酶SacI線性化，將線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，涂布于含有100 μg/mL Zeocin的YPD平板，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，篩選轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子用無菌移液槍頭分別點在含有600、1 000、1 800 μg/mL Zeocin的YPD平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。根據(jù)菌株所能耐受抗生素濃度的上限，將重組菌株依次命名為Zα-100、Zα-600、Zα-1000、Zα-1800。

將重組菌株轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按1%的接種量轉(zhuǎn)入BMGY培養(yǎng)基中，28 ℃，250 r/min培養(yǎng)到OD600為6時，室溫5 000 r/min離心5 min收集菌體，將菌體全部轉(zhuǎn)移到BMMY培養(yǎng)基中，每隔24 h補加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)144 h后取樣。采用Bradford法[17]檢測上清液中的蛋白濃度，SDS-PAGE法檢測CPY酶原的表達(dá)。

1.5 表達(dá)載體pGAPZα-proCPY的構(gòu)建

將CPY基因通過酶切連接的方式連接到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZα上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含有25 μg/mL Zeocin的Low Salt LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化子。

1.6 重組菌株pGAPZα-proCPY/GS115的篩選及表達(dá)

將測序正確的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ線性化之后，電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，在含有100 μg/mL的YPD平板篩選轉(zhuǎn)化子，通過提高抗生素濃度的方法篩選得到重組菌株GAP-100、GAP-600、GAP-1000和GAP-1800。

將重組菌轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD試管中，過夜培養(yǎng)后，按1%的接種量轉(zhuǎn)入含有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 ℃，250 r/min培養(yǎng)144 h后取樣，采用Bradford法檢測胞外總蛋白濃度，SDS-PAGE法檢測CPY酶原的表達(dá)。

1.7 共表達(dá)BIP重組菌株的構(gòu)建及表達(dá)

設(shè)計引物G418 up和G418 down如表1所示，以pPIC9K為模板PCR得到G418的抗性基因，將PCR產(chǎn)物純化后作為引物，以pGAPZ-BIP質(zhì)粒(BIP為畢赤酵母來源。Gene Bank登錄號，XM_002490982.1)為模板進(jìn)行PCR，用限制性內(nèi)切酶DpnI消除模板之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。將抗性替換的質(zhì)粒pGAPG-BIP用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ線性化，轉(zhuǎn)入篩選得到的重組菌Zα-600、Zα-1000和Zα-1800中，涂布于含有2 mg/mL G418的YPD平板， 28℃培養(yǎng)2～3 d，篩選轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表達(dá)，用SDS-PAGE檢測羧肽酶Y酶原的表達(dá)。用軟件Image Lab 6.0分析CPY酶原條帶的灰度值，并與重組菌株Zα-600 CPY酶原條帶灰度值比較。

表1 PCR引物Table 1 PCR pries

1.8 共表達(dá)PDI-ERO1重組菌株的構(gòu)建及表達(dá)

按照質(zhì)粒pGAPG-BIP的構(gòu)建方法，將質(zhì)粒pGAPZ-PDI、pGAPZ-ERO1(PDI為畢赤酵母來源，Gene Bank登錄號:AJ302014.1，ERO1為畢赤酵母來源，Gene Bank登錄號:XM_002489600.1)上的抗性基因替換成G418的抗性基因，得到質(zhì)粒pGAPG-PDI和pGAPG-ERO1。用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ線性化后轉(zhuǎn)入重組菌Zα-600、Zα-1000、Zα-1800中，得到菌株Zα-600-PDI、Zα-1000-PDI、Zα-1800-PDI及Zα-600-ERO1、Zα-1000-ERO1、Zα-1800-ERO1。挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE檢測CPY酶原的表達(dá)。用軟件Image Lab 6.0分析CPY酶原條帶的灰度值，并與Zα-600 CPY酶原條帶灰度值進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)載體pPICZα-proCPY的構(gòu)建

利用雙酶切連接的方法將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的羧肽酶Y(CPY)基因克隆到表達(dá)載體pPICZα上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示，有一條約1 500 bp的條帶，與預(yù)計的1 494 bp相符，將驗證正確的菌株進(jìn)行測序，測序序列完全正確的菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行下一步實驗操作。

M-5 000 bp DNA Marker; 1-PCR產(chǎn)物圖1 pPICZα-proCPY PCR驗證Fig.1 pPICZα-proCPY verification

2.2 重組表達(dá)菌株pPICZα-proCPY/GS115的構(gòu)建及菌株的篩選

將質(zhì)粒pPICZα-proCPY，用限制性內(nèi)切酶SacI線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母中。將得到的轉(zhuǎn)化子分別點在含有不同抗生素濃度的YPD平板上，根據(jù)菌株所能耐受的最高抗生素濃度，得到重組菌株Zα-100、Zα-600、Zα-1000、Zα-1800。將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)144 h后發(fā)酵液上清液經(jīng)SDS-PAGE測試后，分析結(jié)果如圖2所示，重組CPY酶原分子量在60 ku左右，與理論值58.8 ku相符，表明CPY酶原成功實現(xiàn)了分泌表達(dá)；通過不同菌株目的蛋白條帶的比較，可以看出Zα-600的表達(dá)效果要明顯強于其他重組菌株，Bradford法測定發(fā)酵液上清中胞外總蛋白含量達(dá)到了(275±20) mg/L，是現(xiàn)有報道雅致放射毛霉羧肽酶Y在畢赤酵母中表達(dá)量[16]的1.82倍。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker; 1-Zα-100; 2～4-Zα-600; 5～7-Zα-1000;8～9-Zα-1800圖2 重組菌株分泌表達(dá)CPY酶原Fig.2 Recombinant strains secrete CPY zymogen

2.3 表達(dá)載體pGAPZα-proCPY的構(gòu)建

按照質(zhì)粒pPICZα-proCPY的構(gòu)建方法得到質(zhì)粒pGAPZα-proCPY，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，有一條約1500 bp的條帶，與預(yù)計的1494 bp相符，將驗證正確的菌株進(jìn)行測序，測序序列完全正確的菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行下一步實驗操作。

M-5 000 bp DNA Marker; 1-PCR產(chǎn)物圖3 pGAPZα-proCPY PCR驗證Fig.3 pGAPZα-proCPY PCR verification

2.4 重組表達(dá)菌株pGAPZα-proCPY/GS115的構(gòu)建及菌株的篩選

將質(zhì)粒pGAPZα-proCPY用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母。通過提高抗生素濃度的方式篩選重組菌株，得到重組菌GAP-100、GAP-600、GAP-1000、GAP-1800。將轉(zhuǎn)化子在YPD進(jìn)行表達(dá)，144 h后發(fā)酵液上清經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果如圖4-A所示，重組蛋白的分子量大小在60 ku左右與CPY酶原理論值58.8 ku相符，說明CPY酶原實現(xiàn)了成功表達(dá)。通過用軟件Image Lab 6.0對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4-B所示，在所篩選的重組菌中GAP-600-1的分泌表達(dá)效果最好，但是其CPY酶原的分泌量只有重組菌Zα-600的64%。

A-SDS-PAGE，M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker; 1-Zα-600；2：GAP-100;3～6：GAP-600-; 7～8：GAP-1000; 9：GAP-1800;B：灰度值分析圖4 重組菌株pGAPZα-proCPY/GS115分泌表達(dá)CPY酶原Fig.4 Recombinant strains pGAPZα-proCPY/GS115secrete CPY zymogen

2.5 共表達(dá)BIP重組菌株的構(gòu)建及篩選

前期實驗結(jié)果表明重組菌株pPICZα-proCPY/GS115分泌表達(dá)CPY酶原效果pGAPZα-proCPY/GS115要好，因而本實驗選擇在重組菌株pPICZα-proCPY/GS115中共表達(dá)分子伴侶BIP。有研究表明在高拷貝菌株中共表達(dá)分子伴侶的效果要比在低拷貝菌株中的效果好[14]，因而將帶有G418抗性基因的質(zhì)粒pGAPG-BIP用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ線性化后，轉(zhuǎn)入重組菌Zα-600、Zα-1000、Zα-1800中，在含有2 mg/mL G418的YPD平板上得到重組菌Zα-600-BIP、Zα-1000-BIP、Zα-1800-BIP。分別隨機挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)144 h后發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果如圖5-A所示，共表達(dá)分子伴侶BIP后，重組菌中CPY酶原表達(dá)量都有所提升，重組菌Zα-1800-BIP提升尤其明顯。CPY酶原蛋白條帶灰度值分析結(jié)果如圖5-B所示，重組菌Zα-1800-BIP CPY酶原表達(dá)量是重組菌Zα-600的1.87倍，其胞外總蛋白的分泌量達(dá)到了(525±15) mg/L。共表達(dá)的BIP為胞內(nèi)表達(dá)，不分泌到胞外，因此SDS-PAGE中無顯示。

A-SDS-PAGE， M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker; 1-Zα-600;2-Zα-600-BIP; 3-Zα-1000-BIP;4-Zα-1800-BIP圖5 共表達(dá)BIP重組菌株分泌表達(dá)CPY酶原Fig.5 Co-expressing BIP recombinant strains secretCPY zymogen

研究報道BIP具有輔助蛋白質(zhì)折疊，并且促進(jìn)初生肽鏈向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)淖饔肹15]。高拷貝菌株中CPY基因的轉(zhuǎn)錄水平高，但是缺少足夠的伴侶蛋白幫助其初生肽鏈向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸以及初步折疊，影響了CPY酶原分泌表達(dá)，拷貝數(shù)越高的重組菌株影響越嚴(yán)重，當(dāng)在重組菌株中加強BIP(畢赤酵母來源)表達(dá)之后，更多的BIP可以促進(jìn)CPY酶原向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸、并且輔助CPY酶原的折疊。有足夠的BIP來輔助CPY酶原的折疊和運輸之后，高拷貝重組菌Zα-1800的CPY酶原分泌量有了極大的提升，超過了Zα-600共表達(dá)BIP的效果。

2.6共表達(dá)PDI重組菌株的構(gòu)建及篩選

重組菌株Zα-600、Zα-1000、Zα-1800轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pGAPG-PDI，在含有2 mg/mL G418的YPD平板上得到重組菌株Zα-600-PDI、Zα-1000-PDI、Zα-1800-PDI。

隨機挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)144 h后發(fā)酵液上清液經(jīng)SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖6-A所示。從SDS-PAGE圖可以看出共表達(dá)PDI的重組菌中CPY酶原較重組菌Zα-600均有提升，重組菌Zα-1800-PDI提升尤其明顯。CPY酶原條帶的灰度值分析結(jié)果如圖6-B所示，重組菌Zα-1800-PDI CPY酶原表達(dá)量是重組菌Zα-600的1.71倍。共表達(dá)的PDI為胞內(nèi)表達(dá)，不分泌到胞外，SDS-PAGE圖上無顯示。

A-SDS-PAGE； M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker; 1-Zα-600;2-Zα-600-PDI; 3-Zα-1000-PDI; 4-Zα-1800-PDI;B-灰度值分析圖6 共表達(dá)PDI重組菌株分泌表達(dá)CPY酶原Fig.6 Co-expressing PDI recombinant strains secret CPY zymogen

有研究者通過在重組菌株中共表達(dá)PDI，將蛋白的分泌表達(dá)量提升到了原來的2.2倍[16]，本研究構(gòu)建重組菌Zα-600-PDI、Zα-1000-PDI、Zα-1800-PDI，分泌表達(dá)結(jié)果顯示，共表達(dá)PDI對CPY酶原的分泌有較大的促進(jìn)作用，在拷貝數(shù)越高的菌株中作用越明顯。PDI具有輔助二硫鍵的形成和分子伴侶的作用[14]。在高拷貝菌株中CPY基因的轉(zhuǎn)錄水平很高，但是CPY酶原因缺少足夠的分子伴侶輔助折疊，導(dǎo)致無法分泌胞外，共表達(dá)PDI之后，更多的PDI可以輔助蛋白的折疊，因而有更多的CPY酶原可以分泌到胞外去。

2.7 共表達(dá)ERO1重組菌株的構(gòu)建及篩選

在重組菌株Zα-600、Zα-1000、Zα-1800轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pGAPG-ERO1，在含有2 mg/mL G418的YPD平板上得到重組菌Zα-600- ERO1、Zα-1000- ERO1、Zα-1800- ERO1。

隨機挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)144 h后發(fā)酵液上清液經(jīng)SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖7所示，共表達(dá)ERO1的重組菌中CPY酶原較重組菌Zα-600均有略微的提升。CPY酶原條帶的灰度值分析結(jié)果如圖7-B，重組菌Zα-1800-ERO1 CPY酶原表達(dá)量是重組菌Zα-600的1.26倍。共表達(dá)的ERO1為胞內(nèi)表達(dá)，不分泌到胞外，SDS-PAGE圖無顯示。

ERO1在PDI輔助二硫鍵作用過程中起著幫助PDI再生的作用[14]。有研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)單獨共表達(dá)ERO1時，蛋白的分泌量提升到了原來的2.3倍，比共表達(dá)PDI的效果還要好[15]。本研究結(jié)果顯示在畢赤酵母中分泌表達(dá)雅致放射毛霉羧肽酶Y，分子伴侶ERO1中的作用有限。推測可能形成二硫鍵并不是限制CPY酶原分泌表達(dá)過程中的重要步驟。

在畢赤酵母中分泌表達(dá)雅致放射毛霉羧肽酶Y所得到的是具有前導(dǎo)肽的酶原，在體外可以在胰蛋白酶[16]的作用下，切除前導(dǎo)肽得到成熟的羧肽酶Y。

3 結(jié)論

本文在畢赤酵母中異源表達(dá)雅致放射毛霉羧肽酶Y分別構(gòu)建了含有AOX1啟動子和GAP啟動子的重組菌，篩選得到高效分泌CPY酶原的重組菌Zα-600。通過篩選得到的具有不同拷貝數(shù)的Zα系列重組菌中，共表達(dá)分子伴侶BIP、PDI、ERO1，表達(dá)效果最佳的重組菌Zα-1800-BIP將CPY酶原的分泌量提升到了Zα-600的1.82倍，胞外總的蛋白量達(dá)到了(525±15) mg/L。