張 戈，張小江，胡繼紅，楊 青，徐志鵬，范 欣，朱華棟，馬小軍，隆 云，徐英春

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院，侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730；2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院，北京 100730；3.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，杭州 310003)

血流感染(bloodstream infection，BSI)是病原微生物進入血流引起臨床常見的全身性感染疾病。為了減少其對人類健康造成的危害，血培養(yǎng)的重要性日益凸顯。血培養(yǎng)是目前診斷血流感染的有效標準[1]，而全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)的出現(xiàn)，在縮減檢測時間的同時，更提高了陽性檢出率。LABSTAR120是由我國山東鑫科生物技術(shù)股份有限公司自主研發(fā)，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)，本研究對該系統(tǒng)及其配套血培養(yǎng)瓶進行模擬標本以及臨床標本的評估，驗證國產(chǎn)全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)及配套血培養(yǎng)瓶性能。

1 材料與方法

1.1 實驗方案 本研究評估國產(chǎn)LABSTAR120全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)(簡稱LABSTAR，山東鑫科生物科技股份有限公司)及配套需養(yǎng)瓶(成人抗生素中和增菌培養(yǎng)瓶)和厭氧瓶(厭氧抗生素中和增菌培養(yǎng)瓶)，對照產(chǎn)品為美國BD BACTEC FX200全自動血培養(yǎng)儀(簡稱BD，美國BD公司)及配套使用需養(yǎng)瓶(BD BACTEC PLUS Aerobic/F)和厭氧瓶(BD BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F)。本次評估分模擬樣本和多中心收集的臨床樣本兩部分。再分別對需養(yǎng)瓶組和厭氧瓶組進行評估。模擬樣本及入組的臨床樣本均同時平行操作LABSTAR及BD血培養(yǎng)瓶接種并上機自動孵育進行檢測。

1.2 模擬樣本評估

1.2.1 菌株來源：需氧瓶組評估的標準菌株模擬樣本共23例，包含21例ATCC標準菌，衛(wèi)生部2014年2號質(zhì)控菌株(WSB1402)腸炎沙門菌和衛(wèi)生部2014年8號質(zhì)控菌株(WSB1408)A群鏈球菌。厭氧瓶組評估的模擬樣本共15例，包含14株ATCC標準菌及1株臨床分離厭氧菌第三梭菌。菌種目錄見表1。

1.2.2 菌液稀釋及計數(shù)：用濃度0.9 g/dl的無菌生理鹽水配制0.5標準麥氏濃度的菌懸液(細菌約1.5 ×108CFU/ml，真菌約1×106～5×106CFU/ml)。將細菌的菌懸液進行連續(xù)兩次1∶1 000稀釋及一次1∶100稀釋；真菌的菌懸液只進行連續(xù)兩次1∶1 000稀釋，以得到理論濃度為101CFU/ml的終濃度菌懸液，然后取1 ml終濃度菌懸液平行注入待評估和對照需養(yǎng)瓶并上機檢測。同時取0.5 ml終濃度菌懸液密集涂布于三塊平板(哥倫比亞血平板或玫紅酸中國藍乳糖瓊脂平板或巧克力瓊脂平板)，在35℃，5 ml/dl CO2條件下培養(yǎng)20 h，用于菌落計數(shù)(用3塊平板上生長的菌落個數(shù)，計算均值得到每毫升CFU數(shù))。厭氧菌第三梭菌和脆弱擬桿菌涂布三塊厭氧血平板并放置于厭氧環(huán)境培養(yǎng)。記錄3塊平板上生長的菌落個數(shù)計算均值，預(yù)測模擬樣本最終實際接種菌的數(shù)量。

1.3 臨床樣本評估

1.3.1 樣本來源：臨床評估按照統(tǒng)一評估方案在我國3家三級甲等綜合醫(yī)院分別進行。對臨床疑似或明確血流感染的患者按標準操作流程每瓶等量采集外周血8～10 ml接種于LABSTAR和BD血培養(yǎng)瓶，及時送至微生物實驗室全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)上機檢測。同類型培養(yǎng)瓶同時采集于同一患者視為1例，3家中心需氧瓶組評估共入組樣本531例；厭氧瓶組評估共計入組樣本361例。

1.3.2 血培養(yǎng)報警處理及結(jié)果分析：需氧瓶陽性報警后，立即用無菌注射器抽取瓶內(nèi)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板，玫紅酸中國藍乳糖瓊脂平板和巧克力瓊脂平板，置于35℃，5 ml/dl CO2培養(yǎng)箱過夜，同時作涂片革蘭染色鏡檢。厭氧瓶陽性報警后，除上述操作外，再轉(zhuǎn)種厭氧血平板于厭氧環(huán)境培養(yǎng)。上機培養(yǎng)5天未報警，按陰性結(jié)果卸瓶。本研究中陽性報警時間超過24 h，且鑒定結(jié)果為血漿凝固酶陰性葡萄球菌或其他常見皮膚定植菌，則判定為血培養(yǎng)污染[2，3]。統(tǒng)計兩個血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測結(jié)果的一致率(CA%)，并比較兩個系統(tǒng)陽性培養(yǎng)結(jié)果的報警時間，采用SPSS22.0分析軟件進行兩組間差異統(tǒng)計，采用配對t檢驗進行分析。

2 結(jié)果

2.1 模擬樣本評估 兩種血培養(yǎng)系統(tǒng)模擬樣本評估中，需養(yǎng)瓶組和厭氧瓶組陽性報警時間及樣本菌落計數(shù)結(jié)果對比見表1。需氧瓶組評估23例，兩系統(tǒng)全部陽性報警，一致率100%。評估產(chǎn)品LABSTAR 24 h陽性率69.60%，48 h陽性率95.70%，72 h陽性率100%。評估產(chǎn)品報警時間均值為20.50±11.34 h，對照產(chǎn)品報警時間均值為20.04±9.20 h，二者陽性報警時間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.734)。厭氧瓶組評估15例，兩系統(tǒng)并未全部陽性報警，LABSTAR報警14例，24 h陽性率71.43%，48 h陽性率85.71%，72 h陽性率100%。評估產(chǎn)品對脆弱擬桿菌模擬樣本未報警，對照產(chǎn)品對白色念珠菌、近平滑念珠菌模擬樣本并未報警。對于模擬樣本，評估產(chǎn)品報警時間均值為15.46±1.25 h，對照產(chǎn)品報警時間均值為12.37±0.77 h，兩系統(tǒng)報警時間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.023，)。

2.2 臨床樣本評估 需養(yǎng)瓶組共計評估入組臨床樣本531例。有25例陽性結(jié)果及487例陰性結(jié)果一致，總體結(jié)果一致率為96.4%(512/531)。另有11例樣本呈假陰性結(jié)果，即對照產(chǎn)品陽性報警，但評估產(chǎn)品為陰性結(jié)果。同時有8例樣本評估產(chǎn)品陽性，但對照產(chǎn)品為陰性結(jié)果，其中有5例轉(zhuǎn)種后發(fā)現(xiàn)實為陰性，為評估產(chǎn)品系統(tǒng)假陽性報警，見表2。在需養(yǎng)瓶組臨床樣本中25例同時陽性報警，評估產(chǎn)品的陽性報警時間普遍長于對照產(chǎn)品。評估產(chǎn)品報警時間平均值為36.8±31.1 h；對照產(chǎn)品報警時間平均值為24.1±21.5 h，比較分析二者報警時間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.01，<0.05)。

表1 兩種血培養(yǎng)系統(tǒng)模擬樣本陽性報警時間比較

注：“/”未做。

表2 兩種血培養(yǎng)系統(tǒng)19例臨床樣本需養(yǎng)瓶組陽性報警及轉(zhuǎn)種結(jié)果比較

注：(-)為培養(yǎng)結(jié)果陰性。

厭養(yǎng)瓶組共計361例臨床樣本入組。有8例陽性結(jié)果及338例陰性結(jié)果一致，總體結(jié)果一致率95.8%(346/361)。另有6例樣本呈假陰性結(jié)果，即BD陽性報警，但LABSTAR為陰性結(jié)果，假陰性結(jié)果最終菌種鑒定結(jié)果，同時有9例樣本LABSTAR陽性，但BD為陰性結(jié)果，見表3。在厭養(yǎng)瓶組臨床樣本中8例同時陽性報警，LABSTAR的陽性報警時間多數(shù)長于BD。LABSTAR報警時間平均值為18.8±10.3 h，BD報警時間平均值為16.5±15.7 h，比較分析二者報警時間差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.612，>0.05)。

表3 兩種血培養(yǎng)系統(tǒng)15例臨床樣本厭養(yǎng)瓶組陽性報警結(jié)果比較

注：(-)為培養(yǎng)結(jié)果陰性。

3 討論

近年來隨著醫(yī)療水平的提高，侵入性治療操作的增加，免疫抑制劑和皮質(zhì)激素以及抗生素的不合理應(yīng)用使耐藥菌愈演愈烈，導致血流感染的病死率逐年上升。因此用最短的時間從疑似血流感染的血液中檢出病原菌，是臨床醫(yī)生對病人明確診斷和有效治療的關(guān)鍵因素。從前臨床血培養(yǎng)只能依靠手工方法，不僅檢測敏感性低且受主觀因素較大，影響檢測結(jié)果因素很多[4]?，F(xiàn)如今血培養(yǎng)系統(tǒng)因操作簡便，靈敏度及陽性檢出率高[5]而廣泛應(yīng)用于我國三甲醫(yī)院。目前絕大部分三級醫(yī)院使用的都是美國BD公司和法國梅里埃公司等進口的血培養(yǎng)系統(tǒng)[6]，儀器及耗材成本昂貴使之對醫(yī)院及患者的經(jīng)濟負擔較大。故應(yīng)臨床對我國自主研發(fā)有國際競爭力的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的需求，本研究在多中心開展完成標本采集及數(shù)據(jù)統(tǒng)計工作，評估國產(chǎn)LABSTAR 120全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)及其配套血培養(yǎng)瓶。研究選擇的模擬標本涵蓋臨床常見及少見細菌和真菌，結(jié)果中可見評估產(chǎn)品在檢測低至1～10 CFU/ml的標本靈敏度高，但報警時間均值長于對照產(chǎn)品。需養(yǎng)瓶組二者報警時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；厭氧瓶組兩者報警時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。所以在模擬標本的評估中需養(yǎng)瓶一致性比厭氧瓶好。臨床標本的評估中需養(yǎng)瓶組入組531例，兩系統(tǒng)總體結(jié)果一致率96.4%。分析陽性報警及轉(zhuǎn)種結(jié)果一致的報警時間，兩系統(tǒng)報警時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在這些陽性標本中，有8例轉(zhuǎn)種結(jié)果為洋蔥伯克霍爾德菌，其報警時間相差14.4～63.6 h不等。若不考慮這8例結(jié)果，評估產(chǎn)品所有報陽標本24h陽性率85.0%，48h陽性率90.0%，所以本研究結(jié)果分析，評估產(chǎn)品需養(yǎng)瓶在培養(yǎng)伯克霍爾德菌屬的能力需在未來的研究中改進。厭氧瓶組入組361例，總體結(jié)果一致率95.8%，分析陽性報警及傳種結(jié)果一致的報警時間，厭氧瓶兩系統(tǒng)報警時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模擬標本需養(yǎng)瓶組23例標本的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，兩個產(chǎn)品不僅在統(tǒng)計學分析中無明顯差異，且評估產(chǎn)品有13例模擬標本的報警時間早于對照產(chǎn)品。但在臨床標本上對照產(chǎn)品顯然表現(xiàn)更好，分析這種差異存在的原因：首先臨床標本采集自病人血液，血液相對于模擬標本的稀釋液生理鹽水來說，有更為復(fù)雜的蛋白、離子等成分，且血液中抗生素會影響病原菌在血培養(yǎng)瓶中正常生長，所以抗生素的使用和采血的時間會對LABSTAR造成較大影響，因此會出現(xiàn)模擬標本評估結(jié)果優(yōu)于臨床標本結(jié)果的情況。對此本研究分析與LABSTAR血培養(yǎng)瓶內(nèi)的樹脂吸附能力有關(guān)，若能完善樹脂的制作工藝，相信評估產(chǎn)品會有與對照產(chǎn)品一樣的良好表現(xiàn)。

其次，培養(yǎng)結(jié)果只有一方檢出陽性，除了因血培養(yǎng)系統(tǒng)未能成功檢測病原菌外，還可能受到血液標本含菌量以及標本血量的影響。有研究表明，菌血癥時血液中病原菌含量低，平均每3 ml血液含有一個致病菌，且當標本量由2 ml增加到20 ml時，培養(yǎng)陽性率可提高30%～50%[7]，所以在實際臨床操作過程當中，評估產(chǎn)品LABSTAR最好將采血量由5～10 ml更改為8～10 ml，以保證采集足量血液樣本提高陽性率。此外，本研究平行操作兩種產(chǎn)品均存在未同時報陽的情況，也印證了文獻中的結(jié)論，即雙套血培養(yǎng)能夠提高血流感染病原菌的檢出率，并有助于鑒別分離菌的定植或污染[8]。

綜上所述，雖然LABSTAR仍與BD存在一定的差距，報陽時間不同程度晚于BD。但是，LABSTAR敏感度較高，與BD一致性較好。所以，國產(chǎn)LABSTAR 120全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)仍然具有很好的臨床推廣意義。