1 背景

豬流行性腹瀉（PED）是經(jīng)口感染豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種病毒性傳染病，其癥狀包括水樣腹瀉和厭食癥[1]。PED造成1到2周齡哺乳仔豬的死亡率50%~100%。隨著日齡增大，斷奶豬即使口服病毒，也可能不表現(xiàn)癥狀或只有短暫的腹瀉。

PED最早于20世紀(jì)80年代初在日本被發(fā)現(xiàn)，1996年也出現(xiàn)了一次全日本的大流行。間隔7年之后，2013年9月，沖繩報(bào)道了PED疫情[2]，該病毒在全國(guó)范圍內(nèi)迅速傳播。分離出的病毒毒株不同于日本以前報(bào)道過(guò)的毒株，在基因上類似于2013年5月

在美國(guó)報(bào)道的毒株。根據(jù)病毒全基因組序列分析，它屬于G2亞型，又稱類美國(guó)型毒株[2]。隨后，日本又分離到另一株G2亞型INDEL（S基因中有插入和缺失）的野毒株[3]。此外，2014年10月報(bào)道的鳥(niǎo)取G2型毒株S基因有較大缺失[4]。目前，像在其他疫情暴發(fā)的國(guó)家一樣，日本養(yǎng)豬場(chǎng)也有多種G2亞型野毒傳播。

疫苗接種是預(yù)防傳染病的理想控制措施[5]。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，肌肉注射的活疫苗或滅活疫苗被引入亞洲國(guó)家[6-7]。如今，一種商業(yè)化口服疫苗在韓國(guó)和菲律賓應(yīng)用[8]。所有這些疫苗都是以G1亞型毒株制作的，與最近全球流行的PEDV毒株不同。自從2013年4月PED在北美暴發(fā)以來(lái)，一種基于SirraVaxSMRNA粒子技術(shù)平臺(tái)的截?cái)郟EDV的S基因制造的疫苗和一種搭配佐劑的全病毒滅活疫苗2013年至2014年期間在美國(guó)應(yīng)用[9-10]。這些北美疫苗使用的是G2亞型毒株。在2014至2015年間，超過(guò)600萬(wàn)劑由G1亞型毒株生產(chǎn)的活疫苗在日本國(guó)內(nèi)市場(chǎng)供應(yīng)。雖然豬場(chǎng)已經(jīng)使用了疫苗，但在日本已接種疫苗的豬場(chǎng)仍然報(bào)道了PED疫情。

在本研究中，為了評(píng)價(jià)G1亞型毒株活疫苗對(duì)新出現(xiàn)的野毒株的防治效果，我們分離出一株G2亞型野毒株，對(duì)接種G1型PEDV疫苗和未接種的懷孕母豬所產(chǎn)仔豬進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)。此外，我們還比較了免疫傳統(tǒng)活疫苗和不免疫疫苗的豬場(chǎng)感染PED哺乳仔豬死亡率，以評(píng)估農(nóng)場(chǎng)接種活疫苗的效果。

2 方法

2.1 病毒分離

在Vero細(xì)胞中分離到一株G2型野毒株，作為攻毒試驗(yàn)的接種物。6頭腹瀉仔豬的空腸是從一個(gè)PED感染的農(nóng)場(chǎng)獲得的。這些病料用Eagle最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM-生命技術(shù)）制備10%（w/v）的混合物，以1 500 r/min，4 ℃離心15 min，上清液經(jīng) 0.22 μm孔徑過(guò)濾。

如前所述，PEDV的病毒分離是在Vero細(xì)胞上進(jìn)行的[11]。將Vero細(xì)胞置于含10%熱滅活胎牛血清、0.3%胰蛋白胨磷酸鹽肉湯（TPB）和抗生素的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種前，去除培養(yǎng)基，用0.3%TPB、0.02%酵母提取物和10 μg/mL胰蛋白酶（Sigma）對(duì)單層細(xì)胞進(jìn)行兩次清洗。樣品用接種培養(yǎng)基接種，37℃吸附90 min后，去除接種培養(yǎng)基，然后在每個(gè)孔中加入4 mL接種培養(yǎng)基。培養(yǎng)于37℃，每天檢測(cè)細(xì)胞病變（CPE）1次。在24孔板中進(jìn)行病毒滴定，連續(xù)10倍稀釋，每次稀釋做4份重復(fù)。每天檢查1次CPE，病毒滴度按RedMuench法測(cè)定[12]，表達(dá)為50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）/mL。

2.2 S基因序列與其他PEDV毒株的比較

病毒RNA是根據(jù)說(shuō)明書使用Trizol試劑盒（生命技術(shù)）從病毒培養(yǎng)物中提取。用高保真轉(zhuǎn)錄因子cDNA合成試劑盒（羅氏診斷試劑盒）從病毒RNA中合成cDNA。用Phusion高保真DNA聚合酶（Finn-zymes）對(duì)cDNA進(jìn)行PCR。根據(jù)先前的報(bào)道，用引物擴(kuò)增出S基因[13]。通過(guò)Fasmac測(cè)序，從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中直接測(cè)定了S基因的核苷酸序列。將一株名為MZ 0116-2/2013的分離株的S基因序列保存在GenBank中（序列號(hào)258163）。應(yīng)用最大似然法，ClustalW、General Time-Reversible（DNA序列演化模型）和MEGA軟件中1 000個(gè)重復(fù)序列的bootstrap試驗(yàn)，進(jìn)行DNA比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析[14]。NetNGlyc 1.0軟件預(yù)測(cè)了潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)[15]。

2.3 動(dòng)物免疫和攻毒試驗(yàn)

3頭懷孕母豬首免前血清中和抗體均為陰性。疫苗（Nisseiken有限公司，批號(hào)B43-1）菌株P(guān)-5V抗原含量在104.5TCID50/2 mL以上，經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)致弱。P-5V屬于G1亞型毒株疫苗。2頭母豬（677號(hào)和826號(hào)）分別在分娩前6周和2周進(jìn)行疫苗接種。一頭未接種疫苗的母豬（72號(hào)）作為陰性對(duì)照。在第1次免疫前以及分娩后4 d和11 d采集母豬血清，測(cè)定抗PEDV的中和抗體滴度。同樣，在產(chǎn)仔當(dāng)天、分娩后4 d和11 d采集乳汁樣本。將采集的母豬血清和乳汁保存在-20℃保存，直至進(jìn)行分析。

所有新生仔豬（接種組：n=15；對(duì)照組：n=11）只飼喂來(lái)自接種組或未接種組母豬的初乳。不再給仔豬喂人工奶。所有仔豬在分娩后4 d口服抗原含量為105.0TCID50/mL的傳代5次的MZ 0116-2/2013株病毒。對(duì)仔豬和母豬的臨床癥狀進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至免疫后7 d。記錄標(biāo)準(zhǔn)如下：正常大便評(píng)分0，大便稀評(píng)分1，腹瀉評(píng)分2，水樣腹瀉評(píng)分3，死亡評(píng)分4。

2.4 中和試驗(yàn)

根據(jù)之前的報(bào)道進(jìn)行了血清和乳汁中的病毒中和抗體試驗(yàn)[11]。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在24孔板上進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)，做連續(xù)2倍稀釋，每份樣品每個(gè)稀釋梯度做3份重復(fù)。將100 μL稀釋血清與含200 TCID50/0.1 mL的等體積P-5V病毒上清液混合，在37℃下孵育90 min。將該混合液接種Vero細(xì)胞融合培養(yǎng)基中，在37℃下孵育90 min。吸附后，去除培養(yǎng)基，用接種后的培養(yǎng)基對(duì)單層膜進(jìn)行二次清洗。在每孔中加入500 μL的接種后培養(yǎng)液，37℃孵育，P-5V菌株已完全適應(yīng)Vero細(xì)胞，表現(xiàn)出明顯的CPE。免疫后1周測(cè)定中和抗體滴度。收集的乳汁在4℃下10 000×g離心15 min，取上清液按血清的同樣步驟進(jìn)行中和試驗(yàn)。病毒中和抗體效價(jià)用能防止病毒復(fù)制的血清最高稀釋度的倒數(shù)表示。

2.5 比較PED流行豬場(chǎng)哺乳仔豬死亡率

通過(guò)比較PED發(fā)病后仔豬的死亡率，對(duì)比不接種豬場(chǎng)，評(píng)價(jià)接種PED活疫苗的使用效果。在本研究中，對(duì)3個(gè)出生到育成農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。3個(gè)農(nóng)場(chǎng)都在2014年4月首次暴發(fā)PED，表1匯總了所列農(nóng)場(chǎng)的情況和免疫措施。在A和B農(nóng)場(chǎng)，按說(shuō)明已將活疫苗 [傳染性胃腸炎（TGE）/PED二聯(lián)疫苗，Nisseiken有限公司]給懷孕母豬注射1次或2次。C豬場(chǎng)懷孕母豬不接種疫苗。A、C農(nóng)場(chǎng)發(fā)生PED暴發(fā)后，對(duì)妊娠母豬進(jìn)行了返飼。根據(jù)每周出生仔豬死亡仔豬數(shù)計(jì)算仔豬死亡率。

表1 受PED影響的農(nóng)場(chǎng)概況

2.6 數(shù)據(jù)分析

分析了野外農(nóng)場(chǎng)乳豬的臨床評(píng)分、中和效價(jià)和死亡率，使用的統(tǒng)計(jì)方法是具有重復(fù)記錄的方差分析，如果效應(yīng)顯著，就在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用單因素方差分析，多重比較用Tukey法。

3 結(jié)果

3.1 S基因的分離及序列分析

從田間樣品中分離得到1株P(guān)EDV。分離出的病毒命名為MZ 0116-2/2013。MZ 0116-2/2013在未傳代時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞融合和合胞體形成等明顯的CPE特征。分離物在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代，共傳代5次（P1~P5）。在P5時(shí)，該分離物的病毒滴度為105.5TCID50/mL。在接種后24 h內(nèi)，在復(fù)制過(guò)程中觀察到 CPE（圖 1a）。

對(duì)43個(gè)PEDV毒株的S基因序列進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果表明，主要分為有INDEL（S基因中有插入和缺失）和沒(méi)有INDEL兩個(gè)分支。非INDEL菌株構(gòu)成第一分支，第二分支含有INDEL菌株。MZ 0116-2/2013菌株已被證實(shí)是類美國(guó)型，不含INDEL的G2亞型毒株（圖1b）。

圖1 PEDV MZ 0116-2/2013株的細(xì)胞培養(yǎng)及遺傳分析

在病毒與細(xì)胞受體相互作用、體外生長(zhǎng)適應(yīng)、誘導(dǎo)中和抗體和對(duì)機(jī)體的致病性等過(guò)程中，PEDV S蛋白起著重要的作用[16]。如圖2所示，我們比較了P-5V疫苗株和新出現(xiàn)的菌株的氨基酸序列。以前對(duì)PEDV的S蛋白的研究已經(jīng)確定了中和表位區(qū)Coe（498-637 aa）、中和表位 SS2（747-754 aa）、SS6（763-770 aa）和 2C10（1 367-1 373 aa）[17-19]。中和表位SS2和2C10在G1和G2亞型病毒之間沒(méi)有區(qū)別，然而，P-5V的SS6與G2亞型病毒SS6存在兩個(gè)氨基酸差異（Leu 763和Asp 765）。在P-5V株中，與所有的G2型病毒的4個(gè)氨基酸（Ala 516、Thr 548、Gly 593和 Gln 632）存在差異，與MZ 0116-2/2013株的1個(gè)氨基酸（Lys 620）存在差異。S蛋白也被稱為Ⅰ型糖蛋白[20]，P-5V疫苗株含有22個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)。G1亞型和G2亞型預(yù)測(cè)的N-連接糖基化位點(diǎn)非常相似，然而，P-5V疫苗株與類美國(guó)型株之間有3個(gè)不同的N連接糖基位點(diǎn)（位于Asn 127、Asn 229 和 Thr 1 192）。

圖2 PEDV S蛋白氨基酸序列的比對(duì)

3.2 攻毒試驗(yàn)中的臨床癥狀

本研究采用MZ 0116-2/2013菌株對(duì)接種或不接種PED活疫苗的母豬所生的仔豬進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)。所有的小豬在MZ 0116-2/2013菌株攻擊前未觀察到臨床癥狀（數(shù)據(jù)未顯示）。攻毒后，接種疫苗和未接種疫苗的母豬所生仔豬在接種后第1天就出現(xiàn)了水樣腹瀉（圖3a）。對(duì)照組仔豬在攻毒后第4天存活率明顯下降，所有仔豬都在第5天死亡。相反，吃到接種疫苗的母豬初乳的哺乳仔豬臨床癥狀在第2天之后得到緩解。第4天，接種組的臨床評(píng)分明顯低于對(duì)照組。第7 天對(duì)照組存活率為 0（0/11），接種組為 80%（12/15）（圖3b）。接種后的母豬在試驗(yàn)期間出現(xiàn)了短暫的厭食癥，而糞便則是正常的。未接種疫苗的母豬在攻毒后1 d或以后出現(xiàn)厭食癥和腹瀉。沒(méi)有接種疫苗的母豬分泌的乳汁減少了，在攻毒第2天或之后，無(wú)法人工收集乳汁。因此，觀察到未接種疫苗的母豬所生仔豬喝大量的水而不是攝入少量的乳汁。然而，所有在試驗(yàn)期間死去的豬的胃里都裝滿了未經(jīng)消化的乳汁。

圖3 攻毒仔豬臨床癥狀評(píng)分及存活率

3.3 母豬血清和乳汁中和抗體效價(jià)

免疫母豬的血清中和抗體效價(jià)在攻毒時(shí)分別為1∶32 和 1∶128（表 2）。在攻毒后的第 7 天，它增加到1∶256 和 1∶512。初乳中和抗體滴度分別為 1∶64 及1∶128，但其值均低于攻毒當(dāng)日的檢出限值，在攻毒7 d后兩頭母豬都上升至1∶128。未接種疫苗的母豬在整個(gè)試驗(yàn)期間一直保持抗體陰性。

表2 母豬血清和乳中和抗體滴度

3.4 受PED影響豬場(chǎng)的活疫苗效果

所有農(nóng)場(chǎng)在PED發(fā)病的那一周仔豬死亡率都是100%，無(wú)論母豬是否接種疫苗（圖4，關(guān)于死仔豬數(shù)量的詳細(xì)信息未列出）。A農(nóng)場(chǎng)在PED發(fā)病前和發(fā)病后1周出生的仔豬死亡率降低，因?yàn)橐呙绻?yīng)有限，A豬場(chǎng)母豬只接種1次疫苗。相比之下，C農(nóng)場(chǎng)母豬沒(méi)有接種疫苗，只接受返飼治療。此外，在A農(nóng)場(chǎng)接種2次疫苗的母豬在PED發(fā)病2周后出生的仔豬沒(méi)有死亡記錄。同樣，在B農(nóng)場(chǎng)PED發(fā)病前和之后1周，仔豬死亡率也有所下降，B場(chǎng)母豬只接種疫苗，沒(méi)有返飼。同樣與母豬只接受返飼治療的C農(nóng)場(chǎng)對(duì)比。

圖4 有PED感染豬場(chǎng)按日齡劃分的哺乳仔豬死亡率

4 討論

在本研究中，我們分離出一種新的G2亞型病毒，并評(píng)價(jià)了一種傳統(tǒng)的活疫苗（以G1亞型病毒為基礎(chǔ)）的效果。接種疫苗的母豬表現(xiàn)出PED特異性抗體反應(yīng)并且初乳中分泌中和抗體。攻毒后，接種疫苗的母豬也表現(xiàn)出快速的抗體應(yīng)答。這種快速的抗體應(yīng)答產(chǎn)生了一種可能的促進(jìn)作用，即母豬感染了從仔豬身上脫落的病毒。上述結(jié)果推斷，通過(guò)對(duì)母豬接種活疫苗有助于降低仔豬的臨床癥狀和死亡率。此外，與未接種疫苗的農(nóng)場(chǎng)相比，接種疫苗的農(nóng)場(chǎng)在PED發(fā)病前后的死亡率有所降低。這些結(jié)果表明，不僅在試驗(yàn)條件下還是在田間農(nóng)場(chǎng)，PED活疫苗都可以減輕感染G2亞型野毒株引起的損傷。此外，研究還表明，給母豬接種活疫苗，可以緩解腹瀉疫情的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列和N-連接糖基化位點(diǎn)的差異可能會(huì)影響疫苗株和G2毒株的抗原性。未來(lái)的研究有必要闡明G1和G2亞型病毒的中和交叉反應(yīng)活性。

自1996年底以來(lái)，日本開(kāi)始使用PED單價(jià)和多價(jià)（抗PED和TGE）活疫苗來(lái)預(yù)防PED。這些疫苗每隔2周或4至8周在母豬妊娠期內(nèi)肌肉注射2次。接種疫苗的母豬分娩后分泌含有抗PEDV中和抗體的乳汁。若要免疫母豬分泌更多含中和抗體的乳汁，按照說(shuō)明書做法，第2次免疫最好是在分娩前2周。仔豬進(jìn)入胃腸道的中和抗體可以中和經(jīng)口感染的PEDV野毒，并阻斷病毒進(jìn)入小腸黏膜上皮細(xì)胞以減輕PED癥狀。這種PED疫苗對(duì)仔豬的免疫機(jī)制被稱為“乳汁免疫”，其作用機(jī)制是通過(guò)母源抗體免疫仔豬，與主動(dòng)免疫機(jī)制不同。未來(lái)的研究應(yīng)該檢測(cè)通過(guò)乳汁免疫是否降低了仔豬感染的病毒載量。

中和抗體被認(rèn)為需要通過(guò)乳汁持續(xù)地供應(yīng)到豬的胃腸道，以防止PED的發(fā)生。當(dāng)由于某種原因仔豬無(wú)法在哺乳期間攝取足夠的初乳時(shí)，會(huì)使PEDV的感染變得更加嚴(yán)重。另一個(gè)問(wèn)題是，當(dāng)中和抗體滴度低的母豬感染大量病毒時(shí)，他們會(huì)出現(xiàn)與減少乳汁分泌有關(guān)的全身癥狀，從而降低了疫苗的全部使用效果。考慮到PED疫苗的上述機(jī)制，充分提高母豬感染PEDV前的免疫水平是預(yù)防PED的重要因素之一。

用仔豬糞便或腸內(nèi)容物對(duì)懷孕母豬進(jìn)行返飼，可誘導(dǎo)腸黏膜免疫。當(dāng)與疫苗結(jié)合時(shí)，返飼有望通過(guò)增強(qiáng)效力來(lái)誘導(dǎo)高水平的免疫。然而，這也會(huì)帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，包括農(nóng)場(chǎng)病毒載量的大幅增加或通過(guò)返飼病料引起豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、輪狀病毒、豬細(xì)小病毒、豬腸道病毒、沙門氏菌、胞內(nèi)勞森氏菌、大腸桿菌和紅斑丹毒絲菌等其他病原的感染。包含PEDV的病料不能長(zhǎng)期保存在一般家用冰箱中，PED再次暴發(fā)時(shí)，不能保證使用時(shí)病料里有足夠的病毒滴度。因?yàn)榭刂品碉暫吞峁┓€(wěn)定的效果是很有挑戰(zhàn)性的，日本政府出版了PED預(yù)防手冊(cè)，除非有獸醫(yī)或相應(yīng)的政府機(jī)構(gòu)參與指導(dǎo)返飼，農(nóng)民不能進(jìn)行返飼[21]。

G2亞型毒株的兩種疫苗已經(jīng)在美國(guó)上市。然而，其療效是有限的。Crawford等報(bào)道了由愛(ài)荷華州的哈里森疫苗公司TM開(kāi)發(fā)的疫苗用于陰性母豬[22]。作為研究結(jié)果，對(duì)照組的平均死亡率為91%，接種組的平均死亡率為69%。即使使用基于G2亞型病毒的毒株，也很難獲得對(duì)PEDV的保護(hù)性免疫。

5 結(jié)論

本文討論了日本目前可用的PED活疫苗在試驗(yàn)室測(cè)試和田間試驗(yàn)的效果。雖然PED活疫苗不能保護(hù)母豬免受病毒感染，但對(duì)新基因亞型的野毒株起到了一定的保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，在日本即使是接種了疫苗的豬場(chǎng)，PED也造成了損害。解決這些問(wèn)題的理想疫苗將為母豬提供黏膜免疫，為仔豬提供更強(qiáng)的乳汁免疫，以保護(hù)母豬和仔豬免受病毒感染。有必要通過(guò)更深入地了解PED的致病機(jī)制，用其他免疫方法代替肌肉注射，并研制出一種有效誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答的抗原，來(lái)進(jìn)一步研制出這樣一種理想的疫苗。