孟慶利，高 虹，黃國英，丁向東，周海深

（1.北京養(yǎng)豬育種中心，北京 昌平 102202；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 海淀 100193）

根據(jù)考古學(xué)家與古生物學(xué)家的研究，我國是世界上最早把野豬馴化為家豬的國家之一[1]。目前，中國是世界上最大的肉類生產(chǎn)國，同時也是最大的肉類消費國，特別是豬肉。我國人口眾多，資源有限，豬的飼料報酬高。而且我國人民的膳食結(jié)構(gòu)是以豬肉為主的，有良好的市場環(huán)境。根據(jù)全球和國內(nèi)對豬肉的消費增長情況來看，可以預(yù)見未來我國的畜牧業(yè)還是以養(yǎng)豬業(yè)為主[2]。生長性狀體現(xiàn)了豬生長性能的好壞，而豬生長性能的好壞是直接體現(xiàn)在豬的產(chǎn)肉量和生長速度等方面的。無論對商品豬還是種豬來說，豬的生長性能越優(yōu)異，意味著可以用更低的成本，在更快的時間內(nèi)使豬出欄，因此生長性狀對于養(yǎng)豬生產(chǎn)有很重要的經(jīng)濟意義。不僅如此，在某些情況下，生長性狀也會對豬的某些性能產(chǎn)生影響。魯春剛等利用279頭法系大白母豬研究了母豬在進行配種時背膘厚對繁殖性能的影響，結(jié)果顯示母豬在配種時的膘情會對其繁殖性能產(chǎn)生重要的影響，配種時的背膘厚度在18~22 mm之間的母豬繁殖性能明顯比處于其他膘情狀況的母豬要好，不管是過肥還是過瘦都會對繁殖性能產(chǎn)生不利的影響，尤其是總產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)。因此在實際的生產(chǎn)中，一定要注意控制母豬在配種時的膘情，使其能發(fā)揮最大的經(jīng)濟效益。除此之外，背膘厚還可以影響后備母豬的初情期[3]。有研究表明，對于洋三元品種的后備母豬來說，后備母豬背膘厚保持在11.00~13.00 mm范圍內(nèi)是最好的，可以更早的進入初情期，為以后配種打好基礎(chǔ)。因此，探究豬生長性狀的遺傳機制、尋找影響生長性狀的遺傳區(qū)域以及基因?qū)ωi的育種工作有著重要的意義，有助于推進我國豬育種工作的相關(guān)研究。

全基因組關(guān)聯(lián)分析是一種通過利用群體水平上的連鎖不平衡，以基因分型技術(shù)為基礎(chǔ)，在全基因組的范圍內(nèi)定位影響表型的遺傳因素的統(tǒng)計遺傳學(xué)分析方法。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）主要是利用遍布整個基因組的分子標記和統(tǒng)計學(xué)分析方法來研究個體表型性狀與某些遺傳變異之間的相關(guān)性，從而找到與表型有關(guān)聯(lián)的遺傳因素。從本質(zhì)上來說，GWAS并不是一種新的QTL定位方法，它的理論原型是候選基因關(guān)聯(lián)分析，首次是人類遺傳學(xué)研究者為了研究人類復(fù)雜疾病的遺傳性因素而提出的。GWAS方法的理論依據(jù)是“常見疾病，常見變異”（Common disease-common variants,CDCV）的假說，即從遺傳學(xué)的角度看，在人類中存在的常見疾病是由常見變異引起的[4]。GWAS不同于傳統(tǒng)研究方法的地方是，它不再完全依賴于系譜信息和重組信息的方法，而是直接利用基因組上SNP與基因的連鎖不平衡信息，使得許多目前生物學(xué)功能還未知的基因都為個體復(fù)雜性狀的研究提供了線索，因此統(tǒng)計效力更高，精確性也更好，GWAS是近年來得到人們認可的研究復(fù)雜性狀的有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗群體

本研究采用的數(shù)據(jù)來自于北京養(yǎng)豬中心，品種是美系大白豬。美系大白的特點是四肢粗壯，體型修長，具有生長速度快，瘦肉率高，生長性狀優(yōu)良的特點。從數(shù)據(jù)庫中調(diào)取美系大白的記錄信息，主要包括豬耳號、父親耳號、母親耳號、廠代碼、出生日期、活體背膘厚、活體眼肌厚、活體眼肌面積、結(jié)測日期等數(shù)據(jù)。本試驗將表型有缺失的個體進行剔除，然后挑選出記錄信息比較完整的個體作為試驗個體。經(jīng)過初步篩選后獲得試驗大白豬共571頭。試驗時間為2016年1月至2017年12月。

1.2 表型數(shù)據(jù)測定

本試驗研究的表型性狀是大白豬的生長性狀，主要選擇了100 kg體重活體背膘厚和達100 kg體重日齡這兩種性狀。100 kg體重活體背膘厚直接反映了該品種豬的脂肪沉積能力，達100 kg體重日齡則是豬生長速度的表觀性狀。在表型數(shù)據(jù)采集的過程中，利用活體背膘儀來測定樣本群體的100 kg體重活體背膘厚，利用結(jié)測日齡和結(jié)測體重計算達100 kg體重日齡。

1.3 表型數(shù)據(jù)校正

由于在對試驗群體進行測定時，各個樣本的生長狀態(tài)不同，測定的時間也不同，為了使結(jié)果準確，需要對這種差異進行消除。方法是對測定的活體表型數(shù)據(jù)校正到100 kg時的水平，之后再用于后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。本研究中依照加拿大的校正公式對原始表型數(shù)據(jù)進行校正[5]。校正方法是：

達100 kg校正日齡=測定日齡-[（實測體重-100）/CF]

其中 CF=（實測體重/測定日齡）×1.714 615（母豬）

達100 kg校正背膘厚=實測背膘厚×CF

其中 CF=A/[A+B×（實測體重-100）]，A=13.983；B=0.126 014

1.4 表型清除固定效應(yīng)

雖然所有的樣本豬來自同一個場，場效應(yīng)對試驗沒有影響。但是結(jié)束測定的日期是不同的，不同的年份和季節(jié)對表型的影響是不同的。因此，需要將年季效應(yīng)進行清除。方法是應(yīng)用SAS軟件得到每年每個季度的固定效應(yīng)，然后每頭豬的每個表型值減去相對應(yīng)的年季效應(yīng)值就是每頭豬的真正表型值了。

1.5 樣品采集

對樣本群體進行靜脈采血，使用含有抗凝血劑的真空采血管采集約5 mL血液，然后將采血管放在-20℃冰箱冷藏，以備后續(xù)DNA提取試驗使用。

1.6 豬血液DNA提取

本研究所用樣品為571頭試驗豬的血液樣品，使用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。按照說明書進行具體的操作。

1.7 SNP基因型分型

本研究所應(yīng)用的芯片是Illumina公司的豬80 K芯片（圖1）。該款芯片是由Illumina公司和Genseek公司在改良了之前Illumina Porcine 60 K Beadchip的基礎(chǔ)上開發(fā)出來的，一共包含了68 528個SNP標記。該款芯片不僅繼承了之前60 K芯片中多態(tài)性良好的45 K數(shù)據(jù)，還新增加了通過后續(xù)研究找到的25 K SNP標記信息，這些SNP位點中有很多與豬的生長性狀相關(guān)的位點，并且這些標記在每條染色體上的分布也是相對均勻的。

圖1 80 K芯片SNP位點在各染色體上的分布

1.8 基因型數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

由于系統(tǒng)可能存在誤差或者某些不可控制情況的發(fā)生，基因型數(shù)據(jù)并不是總能達到試驗的要求，因此在進行進一步的關(guān)聯(lián)分析之前需要對基因型數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制。根據(jù)以往的研究中對芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制標準，本研究的芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控標準如下：

（1）單個位點SNP的檢出率（call rate）達到90%以上；

（2）個體的call rate達到90%以上；

（3）SNP位點的最小等位基因頻率大于等于0.05；

（4）單個SNP位點的哈代-溫伯格平衡檢驗P值大于等于0.000 001。

1.9 統(tǒng)計分析方法

本研究采用的是線性模型的單標記回歸分析方法，具體模型如下：

Y=u+bx+e

Y是經(jīng)過校正的性狀表型值，剔除了年份和季節(jié)固定效應(yīng)，u是群體均值，b是SNP效應(yīng)，x是指SNP基因型的指示向量，可以編碼為0、1或2。e是隨機殘差。

2 結(jié)果與分析

應(yīng)用PLINK軟件對試驗群體的生長性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析之前需要對試驗群體的基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)處理成滿足PLINK軟件包對GWAS分析所需要的文件格式。

2.1 表型分布情況

該研究選取了100 kg日齡和活體背膘厚兩個生長性狀進行分析。圖2所示是兩個性狀的頻數(shù)分布圖，橫坐標是指表型值，縱坐標是表型值在某一范圍內(nèi)分布的頻數(shù)。A圖代表的是100 kg日齡的分布情況，B圖代表活體背膘厚的分布情況。從圖2中可以看出兩個性狀都基本符合正態(tài)分布，因此是具有可靠性的，可以進行后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。

圖2 兩個性狀的頻數(shù)分布

2.2 GWAS分析結(jié)果

在剔除了數(shù)據(jù)記錄不完整的個體和每個個體的年季效應(yīng)之后就得到了該樣本群用于關(guān)聯(lián)分析的表型數(shù)據(jù)，一共有571個個體。

芯片數(shù)據(jù)處理成進行關(guān)聯(lián)分析所需要的格式之后共有68 528個SNP位點，經(jīng)過質(zhì)量控制之后還有54 867個SNP位點。

本研究對571頭大白豬個體的生長性狀進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，并采用FDR方法對關(guān)聯(lián)分析得到的P值進行多重檢驗校正，共發(fā)現(xiàn)了4個基因組水平顯著的SNP位點與100 kg日齡相關(guān)聯(lián)（表1）；2個基因組水平顯著的SNP位點與活體背膘厚相關(guān)（表 2）。

表1 100 kg日齡基因組水平顯著位點信息

表2 背膘厚基因組水平顯著位點信息

通過R語言使用Python對所研究的兩個生長性狀做了曼哈頓圖，可以更直觀的表現(xiàn)出顯著的SNP所在的染色體以及P值。圖3展示的是100 kg日齡的GWAS分析結(jié)果，顯著的P值為5.99E-07，共有4個顯著的SNP位點。圖4展示的是活體背膘厚的GWAS分析結(jié)果，顯著的P值為1.55E-06，共有2個顯著的SNP位點。

圖4 活體背膘厚全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果曼哈頓圖

2.3 生物信息學(xué)分析

在對生長性狀進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，并經(jīng)過多重檢驗校正，本研究共找到了4個與100 kg日齡相關(guān)的基因組水平顯著的SNP位點和2個與活體背膘厚相關(guān)的基因組水平顯著的SNP位點。進而利用EnseMble在線平臺的豬SusScrofa 10.2版本數(shù)據(jù)庫，將顯著的SNP位點向上下游各擴展1 Mb進行基因富集分析，在豬的基因組上共找到了25個與研究性狀相關(guān)的基因。其中與100 kg日齡相關(guān)的有9個，與活體背膘厚相關(guān)的有16個。具體信息見表3、表 4。

表3 100 kg日齡富集基因和信息

表4 背膘厚富集基因和信息

3 討論

3.1 GWAS在遺傳育種中的應(yīng)用

GWAS所依據(jù)的原理是在染色體中存在大量與表型有關(guān)或者與表型處于連鎖不平衡（LD）狀態(tài)的標記，并且這種連鎖不平衡是可以遺傳的[6-7]，所以結(jié)合這些比較穩(wěn)定的LD信息，利用統(tǒng)計模型就可以分析出每個標記對相應(yīng)性狀的效應(yīng)大小。全基因組關(guān)聯(lián)分析是伴隨著高密度芯片的出現(xiàn)而被廣泛應(yīng)用的，并且表現(xiàn)出來巨大的優(yōu)勢。這是因為GWAS是通過利用大量無關(guān)個體的基因組信息，并對它們進行整合，通過整合，幾乎可以將基因組水平上的所有SNP都涵蓋其中，這樣每一個與性狀有關(guān)的QTL都會找到與之連鎖的所有SNP，同時該種方法不需要預(yù)設(shè)一些假定條件，避免了這些假設(shè)的限制，從而相較于其他方法更顯優(yōu)勢。

GWAS的應(yīng)用首次是于2005年在Science雜志發(fā)表的關(guān)于具有年齡相關(guān)性的黃斑變性研究[4]，成功定位到CFH和HTRA1兩個位點的SNP與年齡性黃斑具有比較強的關(guān)聯(lián)性。隨后，通過GWAS研究相繼找到了與冠心病[8]、肥胖癥[9]等疾病有關(guān)的顯著位點。隨著GWAS在人類疾病上面發(fā)揮的顯著作用，其在動物上的應(yīng)用，特別是與經(jīng)濟性狀有關(guān)的表型研究也漸漸增多。對動物的某些性狀進行GWAS分析需要滿足兩個條件：一是群體的遺傳背景要相同或者相似；二是要具有覆蓋全基因組的高密度的標記。為了保證獲得最大的經(jīng)濟效益，以最低的成本獲得最顯著的結(jié)果，性狀的遺傳基礎(chǔ)、表型的測定方式、質(zhì)量的控制標準、試驗設(shè)計的合理性、樣本量大小、統(tǒng)計分析方法等都是需要考慮的[10]。

3.2 GWAS在豬育種中的研究進展

通過對生長性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，并經(jīng)過FDR檢驗校正，本研究在100 kg日齡性狀中找到了4個基因組水平顯著的SNP位點在WU_10.2_15_142776834、WU_10.2_15_142743420、WU_10.2_15_142698412、WU_10.2_15_142730007。背膘厚性狀中找到了2個基因組水平顯著的SNP位 點 ALGA0005769、ASGA0004384。 進 而 利 用EnseMble在線平臺的豬SusScrofa 10.2版本數(shù)據(jù)庫，將顯著的SNP位點向上下游各擴展1 Mb進行基因富集分析，定位到了可能與生長性狀有關(guān)聯(lián)的基因。其中，與100 kg體重日齡相關(guān)的基因有9個，分別是SLC19A3、CCL20、DAW1、SPHKAP、RHBDD1、IRS1、COL4A4、TM4SF20、AGFG1；與活體背膘厚相關(guān)的基因有 16個，分別是 ONECUT1、ARPP19、MYO5A、MYO5C、GNB5、BCL2L10、MAPK6、LEO1、TMOD3、SCG3、LYSMD2、TMOD2、DMXL2、GLDN、CYP19A1、TNFAIP8L3。

與活體背膘厚有關(guān)的基因中，根據(jù)郭正陽等的關(guān)于ONECUT轉(zhuǎn)錄因子在消化系統(tǒng)器官發(fā)育和疾病發(fā)生中的功能研究發(fā)現(xiàn)，ONECUT轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)基因表達，參與細胞周期和增殖調(diào)控、細胞分化以及器官的形成、遷移和基質(zhì)黏附、物質(zhì)代謝等多個方面起著重要的生物學(xué)功能，并影響消化系統(tǒng)的器官發(fā)育及疾病的發(fā)生[11]。ARPP19可以通過抑制蛋白磷酸酶2a來控制有絲分裂[12]。但是可能由于試驗群體比較小，比較單一，所以并沒有找到與所研究性狀直接相關(guān)的基因。

4 結(jié)論

本研究對大白豬背膘厚和100 kg日齡兩個生長性狀進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果找到2個基因組水平顯著的SNP位點與背膘厚性狀相關(guān)，4個基因組水平顯著的SNP位點與100 kg日齡性狀相關(guān)。

通過生物信息學(xué)分析在這些顯著位點上下游1 Mb范圍內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了25個基因，這些基因具有調(diào)節(jié)細胞周期、促進細胞生長發(fā)育、參與脂肪和蛋白質(zhì)的合成與分解、參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等功能。其中ARPP19可以控制有絲分裂，ONECUT1具有促進細胞分裂和生長發(fā)育的功能，因此這兩個基因最可能與生長性狀存在功能聯(lián)系。