武曉東，馮萬宇，周慶民，張 艷，侯美如

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

腐蹄病是奶牛最常見疾病，患病牛會(huì)出現(xiàn)跛行、運(yùn)動(dòng)困難、泌乳及繁殖性能下降等臨床癥狀，嚴(yán)重者將予以淘汰，即使治愈后也會(huì)縮短使用周期，非常影響奶牛業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)殖者帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)對(duì)齊齊哈爾某規(guī)?；膛?chǎng)腐蹄病病料進(jìn)行病原分離鑒定，通過病原菌藥敏試驗(yàn)，為臨床治療提供了理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 病 料

齊齊哈爾周邊某場(chǎng)奶牛病蹄組織，共計(jì)10頭份。

1.2 主要試劑及藥品

1.2.1 培養(yǎng)基制備常用試劑

蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二鈉、七葉苷、氯化鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、硝酸鹽相關(guān)試劑購(gòu)自齊齊哈爾醫(yī)藥商廈。

1.2.2 藥敏片

青霉素鈉、頭孢拉定、氨芐西林鈉、舒巴坦鈉、硫酸鏈霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、克林霉素、紅霉素、萬古霉素、甲硝唑等藥敏紙片購(gòu)自上海騰騫生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 LDZX-75KBS立式蒸汽滅菌器：上海申安；CKX31倒置顯微鏡：奧林巴斯（中國(guó)）；HYQX-I厭氧培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)；AIN100恒溫培養(yǎng)箱：重慶優(yōu)邁。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 病料采集處理 在蹄部病變部位用滅菌注射器直接吸取深部膿汁排出氣泡后，將針頭插入無菌的橡皮塞內(nèi)，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

將膿汁直接料涂于載玻片上，干燥固定后染色鏡檢。

2.2 病原分離培養(yǎng)

2.2.1 增菌培養(yǎng) 將病料接種于厭氧培養(yǎng)基，置于37℃恒溫箱厭氧和有氧培養(yǎng)48h以上，染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。將疑似病原菌的培養(yǎng)基放在－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 病原分離 取疑似病原接種肉湯進(jìn)行厭氧增菌培養(yǎng)48h，然后取1mL注射試驗(yàn)兔頸部皮下，根據(jù)發(fā)病情況，隔3～5d再接種1次。采取死亡或發(fā)病兔肝臟壞死灶接種厭氧血瓊脂培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕?7℃厭氧培養(yǎng)2～3d后，挑取單個(gè)菌落鏡檢觀察。同時(shí)對(duì)死亡兔子進(jìn)行剖檢，觀察病理變化；取病變組織涂于載玻片染色鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。

2.2.3 病原生化鑒定 將待檢菌接種于有關(guān)生化反應(yīng)管和培養(yǎng)基中，設(shè)相應(yīng)對(duì)照組，37℃厭氧培養(yǎng)48h，觀察生化結(jié)果，同時(shí)涂片鏡檢。

2.2.4 致病性試驗(yàn) 將試驗(yàn)哈白兔均為分為三組，每組6只，第一組在頸部皮下注射濃度為11.43×109/mL病原菌菌液1mL；第二組在頸部皮下別注射濃度為11.34×109/mL純壞死梭桿菌標(biāo)準(zhǔn)株菌液1mL，第三組為對(duì)照組，皮下注射生理鹽水1mL，注射后觀察動(dòng)物發(fā)病情況。

2.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將普通肉湯純培養(yǎng)菌液均勻涂布普通瓊脂平板，貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 涂片鏡檢結(jié)果 對(duì)采集的病料直接涂片染色鏡檢，可見病料中有大量典型革蘭氏陰性長(zhǎng)絲狀桿菌，該菌在厭氧血瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、中央凸起、邊緣不整齊、灰白色大小不一菌落，典型β溶血。在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一致，能分解肉渣，有腐臭味。厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后呈均一的細(xì)桿狀。同時(shí)分離到其他雜菌。

3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖并產(chǎn)氣，但反應(yīng)不劇烈，產(chǎn)生硫化氫和吲哚，使牛乳凝固并消化、有β溶血、脂酶降解陽性、不還原硝酸鹽和水解七葉苷、液化明膠、有膽汁時(shí)候存在不生長(zhǎng)，無運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果，該菌與壞死梭桿菌生理生化特性基本一致。

3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 兔子接種3d后陸續(xù)發(fā)病后發(fā)病，接種部位出現(xiàn)膿包和紅腫，內(nèi)有大量濃汁，膿腫附近肌肉逐漸腫大，營(yíng)養(yǎng)不良，精神沉郁，逐漸消瘦，15d后相續(xù)死亡。剖檢可見肝脾明顯腫大、表面有黃白色壞死灶。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無發(fā)病和死亡現(xiàn)象（表2）。

3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)分離出的壞死梭桿菌做臨床常用藥物藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)頭孢拉定、青霉素和氨芐西林高度敏感，對(duì)磺胺、慶大霉素、卡那霉素的嚴(yán)重耐藥（表3）。

4 討論

4.1 病原分離鑒定 對(duì)采集的病料直接涂片鏡檢，可見到有大量長(zhǎng)絲狀革蘭陰性桿菌及其他雜菌，初步診斷為壞死梭桿菌。此外病料中還存在大量輔助菌和環(huán)境常在菌，考慮厭氧菌培養(yǎng)條件苛刻，試驗(yàn)以病料直接接種動(dòng)物進(jìn)行致病試驗(yàn)，在動(dòng)物病變和健患交界處中直接分離病原菌并做生化試驗(yàn)，結(jié)果符合壞死梭桿菌生化特性。

表2 動(dòng)物發(fā)病情況

4.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)直接用分離株接種動(dòng)物試驗(yàn)證明其致病性并在注射部位形成特征性壞死灶。耐過動(dòng)物與死亡動(dòng)物剖檢后病理變化一致。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4.3 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果證實(shí)該菌對(duì)先鋒霉素、克林霉素、青霉素和氨芐西林鈉高度敏感，對(duì)紅霉素中度敏感，對(duì)卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素和磺胺耐藥。由于臨床中頭孢類及青霉素等對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和克雷伯氏桿菌治療效果不明顯。臨床中對(duì)腐蹄病采取廣譜藥物治療效果會(huì)更好。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)該奶牛場(chǎng)奶牛腐蹄病病料病原菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)病原鑒定證實(shí)：采集的奶牛腐蹄病病料中主要病原菌為壞死梭桿菌。藥敏試驗(yàn)證實(shí)，該菌對(duì)臨床中常用先鋒霉素、克林霉素、青霉素和氨芐西林鈉高度敏感，對(duì)紅霉素中度敏感，對(duì)卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素和磺胺耐藥。