武曉東，馮萬宇，周慶民，張 艷，侯美如

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

腐蹄病是奶牛最常見疾病，患病牛會出現(xiàn)跛行、運動困難、泌乳及繁殖性能下降等臨床癥狀，嚴重者將予以淘汰，即使治愈后也會縮短使用周期，非常影響奶牛業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)殖者帶來了很大的經(jīng)濟損失。本試驗對齊齊哈爾某規(guī)?；膛龈悴〔×线M行病原分離鑒定，通過病原菌藥敏試驗，為臨床治療提供了理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 病 料

齊齊哈爾周邊某場奶牛病蹄組織，共計10頭份。

1.2 主要試劑及藥品

1.2.1 培養(yǎng)基制備常用試劑

蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二鈉、七葉苷、氯化鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、硝酸鹽相關(guān)試劑購自齊齊哈爾醫(yī)藥商廈。

1.2.2 藥敏片

青霉素鈉、頭孢拉定、氨芐西林鈉、舒巴坦鈉、硫酸鏈霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、克林霉素、紅霉素、萬古霉素、甲硝唑等藥敏紙片購自上海騰騫生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 LDZX-75KBS立式蒸汽滅菌器：上海申安；CKX31倒置顯微鏡：奧林巴斯（中國）；HYQX-I厭氧培養(yǎng)箱：上海躍進；AIN100恒溫培養(yǎng)箱：重慶優(yōu)邁。

2 實驗方法

2.1 病料采集處理 在蹄部病變部位用滅菌注射器直接吸取深部膿汁排出氣泡后，將針頭插入無菌的橡皮塞內(nèi)，運送至實驗室。

將膿汁直接料涂于載玻片上，干燥固定后染色鏡檢。

2.2 病原分離培養(yǎng)

2.2.1 增菌培養(yǎng) 將病料接種于厭氧培養(yǎng)基，置于37℃恒溫箱厭氧和有氧培養(yǎng)48h以上，染色鏡檢，觀察細菌形態(tài)。將疑似病原菌的培養(yǎng)基放在－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 細菌生化試驗結(jié)果

2.2.2 病原分離 取疑似病原接種肉湯進行厭氧增菌培養(yǎng)48h，然后取1mL注射試驗兔頸部皮下，根據(jù)發(fā)病情況，隔3～5d再接種1次。采取死亡或發(fā)病兔肝臟壞死灶接種厭氧血瓊脂培養(yǎng)基，放入?yún)捬豕?7℃厭氧培養(yǎng)2～3d后，挑取單個菌落鏡檢觀察。同時對死亡兔子進行剖檢，觀察病理變化；取病變組織涂于載玻片染色鏡檢觀察細菌形態(tài)。

2.2.3 病原生化鑒定 將待檢菌接種于有關(guān)生化反應(yīng)管和培養(yǎng)基中，設(shè)相應(yīng)對照組，37℃厭氧培養(yǎng)48h，觀察生化結(jié)果，同時涂片鏡檢。

2.2.4 致病性試驗 將試驗哈白兔均為分為三組，每組6只，第一組在頸部皮下注射濃度為11.43×109/mL病原菌菌液1mL；第二組在頸部皮下別注射濃度為11.34×109/mL純壞死梭桿菌標準株菌液1mL，第三組為對照組，皮下注射生理鹽水1mL，注射后觀察動物發(fā)病情況。

2.2.5 藥敏試驗 采用紙片法進行藥敏試驗，將普通肉湯純培養(yǎng)菌液均勻涂布普通瓊脂平板，貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 涂片鏡檢結(jié)果 對采集的病料直接涂片染色鏡檢，可見病料中有大量典型革蘭氏陰性長絲狀桿菌，該菌在厭氧血瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、中央凸起、邊緣不整齊、灰白色大小不一菌落，典型β溶血。在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中生長一致，能分解肉渣，有腐臭味。厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后呈均一的細桿狀。同時分離到其他雜菌。

3.2 生化試驗結(jié)果 由表1可知，分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖并產(chǎn)氣，但反應(yīng)不劇烈，產(chǎn)生硫化氫和吲哚，使牛乳凝固并消化、有β溶血、脂酶降解陽性、不還原硝酸鹽和水解七葉苷、液化明膠、有膽汁時候存在不生長，無運動性。根據(jù)生化試驗結(jié)果，該菌與壞死梭桿菌生理生化特性基本一致。

3.3 動物實驗結(jié)果 兔子接種3d后陸續(xù)發(fā)病后發(fā)病，接種部位出現(xiàn)膿包和紅腫，內(nèi)有大量濃汁，膿腫附近肌肉逐漸腫大，營養(yǎng)不良，精神沉郁，逐漸消瘦，15d后相續(xù)死亡。剖檢可見肝脾明顯腫大、表面有黃白色壞死灶。對照組實驗動物無發(fā)病和死亡現(xiàn)象（表2）。

3.4 藥敏試驗結(jié)果 對分離出的壞死梭桿菌做臨床常用藥物藥敏實驗發(fā)現(xiàn)，該菌對頭孢拉定、青霉素和氨芐西林高度敏感，對磺胺、慶大霉素、卡那霉素的嚴重耐藥（表3）。

4 討論

4.1 病原分離鑒定 對采集的病料直接涂片鏡檢，可見到有大量長絲狀革蘭陰性桿菌及其他雜菌，初步診斷為壞死梭桿菌。此外病料中還存在大量輔助菌和環(huán)境常在菌，考慮厭氧菌培養(yǎng)條件苛刻，試驗以病料直接接種動物進行致病試驗，在動物病變和健患交界處中直接分離病原菌并做生化試驗，結(jié)果符合壞死梭桿菌生化特性。

表2 動物發(fā)病情況

4.2 動物實驗 實驗直接用分離株接種動物試驗證明其致病性并在注射部位形成特征性壞死灶。耐過動物與死亡動物剖檢后病理變化一致。

表3 藥敏試驗結(jié)果

4.3 藥敏試驗 結(jié)果證實該菌對先鋒霉素、克林霉素、青霉素和氨芐西林鈉高度敏感，對紅霉素中度敏感，對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素和磺胺耐藥。由于臨床中頭孢類及青霉素等對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和克雷伯氏桿菌治療效果不明顯。臨床中對腐蹄病采取廣譜藥物治療效果會更好。

5 結(jié)論

本試驗對該奶牛場奶牛腐蹄病病料病原菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)病原鑒定證實：采集的奶牛腐蹄病病料中主要病原菌為壞死梭桿菌。藥敏試驗證實，該菌對臨床中常用先鋒霉素、克林霉素、青霉素和氨芐西林鈉高度敏感，對紅霉素中度敏感，對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素和磺胺耐藥。