周寧寧，王俊云，李淑斌，陳 敏，張 顥，王其剛*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南昆明 650200;2.國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650200;3.云南省花卉技術(shù)培訓(xùn)推廣中心，云南昆明 650000)

【研究意義】豐富耐寒性狀相關(guān)的月季CBF基因的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫?！厩叭搜芯窟M展】植物在經(jīng)受非冰凍低溫脅迫后，其抵御低溫迫害的能力會得到提高，這一現(xiàn)象稱為低溫馴化［1］。在低溫馴化過程中，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子與作用元件特異結(jié)合，調(diào)節(jié)下游抗逆基因的表達，可提高植物對低溫脅迫的抗性［2］。DREB亞家族成員隸屬于AP2/ERF家族，分為6個亞組(A-1亞組至A-6亞組)，其中A-1亞組成員在植物低溫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用［3］。模式植物擬南芥基因組中A-1亞組含有4個DREB1/CBF和2個 DDF轉(zhuǎn)錄因子［4］，其中CBF1、CBF2及CBF3在冷脅迫下能夠被快速誘導(dǎo)激活［5］，調(diào)控下游100多個基因的表達，同時CBFs之間又相互調(diào)控，致使其低溫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜［6］。近年來，DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子在月季中的功能研究取得了一定的進展，如翟俊峰［7］等利用熒光定量PCR分析RhCBF在不同逆境脅迫下的表達情況，結(jié)果顯示低溫和鹽脅迫均可以誘導(dǎo)Rh-CBF的表達，而干旱脅迫不能誘導(dǎo)其表達。王婷等［8］用半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，Rh-DREB1A和Rh-DREB1B在月季花瓣中能夠被失水脅迫強烈誘導(dǎo)，但是不受乙烯誘導(dǎo)。Chen等從苜蓿中克隆得到MtDREB1C基因，并分別在苜蓿(Medicago truncatula)和月季花(Rosa Chinensis Jacq.)植株中進行了功能驗證，研究表明在苜蓿中過量表達MtDREB1C會抑制新梢生長和提高植株的耐寒能力，而將Mt-DREB1C轉(zhuǎn)到月季中表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株的耐寒力增強，且不會造成植株的畸形生長［9］。隨后，Chen等利用MtDREB1C基因和RcXET基因構(gòu)建了共表達載體，獲得MtDREB1C和RcXET共表達的轉(zhuǎn)基因月季植株，研究表明該轉(zhuǎn)基因植株具有更強的耐寒和耐旱能力［10］?！颈狙芯壳腥朦c】項目組前期結(jié)合野生資源原生地生境及植株生長情況的調(diào)查和冬季栽培的田間表現(xiàn)，選擇了10個野生種，對其低溫脅迫下葉片相對電導(dǎo)率、脯氨酸、丙二醛、可溶性糖及可溶性蛋白的含量進行了測定。研究表明10個野生種中，峨眉薔薇原變種的耐寒性最強［11－12］。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以峨眉薔薇原變種為材料，克隆獲得了與耐寒相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Ro-DREB1C，借助相關(guān)生物信息學(xué)軟件，分析該基因編碼的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，對其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級、三級結(jié)構(gòu)等進行預(yù)測，并對Ro-DREB1C在擬南芥AP2基因家族各亞組基因成員中構(gòu)建進化樹，明確 Ro-DREB1C與其他月季CBF基因的關(guān)系，及其所隸屬的基因家族，以期為后續(xù)月季DREB亞家族成員的功能研究奠定相應(yīng)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

峨眉薔薇引種于昆明轎子雪山(北緯26°08'44″、東經(jīng) 102°08'46″)，海拔 2300 m［13］，現(xiàn)種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心野生薔薇資源圃。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒EasyPure Plant RNA Kit(ER301)、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix、反轉(zhuǎn)錄引物 Anchored Oligo(dT)20Primer和 Random Primer(N9)、RNase-free Water、TransStart TopTaq DNA Polymerase(AP151)、克隆載體pEASY-T5 Zero Cloning Kit(CT501)等，購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 峨眉薔薇 cDNA的制備 按照 EasyPure Plant RNA Kit(ER301)說明書所示，提取峨眉薔薇嫩莖組織 RNA，并用30 μl RNase-free Water洗脫。用1.5%的瓊脂糖凝膠和Bio Drop Lite PC超微量可見-紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度。然后根據(jù)TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒操作要求，分別利用引物Anchored Oligo(dT)20Primer和Random Primer(N9)反轉(zhuǎn)錄成2種cDNA后于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Ro-DREB1C基因的克隆 根據(jù)GenBank中檢索到的月季品種‘寒錦4號’RhCBF基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計上下游特異引物，盡量避免選擇形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)與二聚體的引物，GC含量不超過46%，預(yù)計擴增大小為600～700 bp。引物序列:上游，5'-TATAAATCCCCATGCTCT-3';下游，5'-GGTCAACAATCCAAGTCA-3'。擴增引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

利用設(shè)計的上下游引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的2種cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系50 μl:cDNA 模 板 3 μl，上 下 游 引 物 各 1 μl，TransStart TopTaq DNA Polymerase 1 μl，dNTP(2.5 mM)5 μl，ddH2O 39 μl。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min，(95℃變性30s+45℃復(fù)性30s+72℃延伸60s)×40個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

選擇擴增效果較好的PCR產(chǎn)物4 μl和pEASYT5 Zero載體1 μl，PCR 儀中25 ℃連接30 min。連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細胞中，42℃熱激30 s，冰上靜置2 min，加入400 μl SOC 培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min搖菌1 h。搖好的菌液4 000 r/min離心1 min后棄上清，取100 μl涂于含氨芐青霉素(Amp+)抗性的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。從平板上隨機挑取白色單菌落，使用上下游引物進行菌落PCR鑒定，取PCR鑒定合格的菌懸液，加入1 mL含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min搖菌過夜。次日送Invitrogen公司測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 利用 Geneious 5.3.6軟件對克隆的Ro-DREB1C全長序列進行基因注釋，并對Ro-DREB1C和RhCBF進行序列比對分析;使用NCBI的 CD-search 工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)搜索氨基酸保守結(jié)構(gòu)域;選用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹;使用Prot-Param(http://web.expasy.org/protparam/)、Predict-Protein(http://www.predictprotein.org)、SWISSMODEL(http://swissmodel.expasy.org/)、Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～ phyre2/html/page.cgi?id=index)TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)等在線軟件分析Ro-DREB1C蛋白的一級結(jié)構(gòu)(理化性質(zhì))、信號肽及亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 峨眉薔薇總RNA質(zhì)量檢測

從峨眉薔薇嫩莖組織提取的RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，點樣孔無異物、下部無DNA條帶，表明該樣品無蛋白質(zhì)和DNA污染;得到帶形完整的3條帶，分別為28S、18S和5S rRNA，RNA完整性較好(圖1)。紫外分光光度儀測定RNA濃度，以備后面實驗所需。

2.2 峨眉薔薇Ro-DREB1C基因目標(biāo)片段的擴增與TA克隆

1～4號樣本是以引物Anchored Oligo(dT)20反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴增的PCR產(chǎn)物，5～8號是以引物Random Primer(N9)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物。結(jié)果如圖2左所示:1號和6號樣本在600～750 bp擴增得到相同大小的條帶。選擇條帶較亮的6號PCR產(chǎn)物進行載體構(gòu)建，培養(yǎng)得到了理想的白色菌落。

圖1 峨眉薔薇嫩莖組織總RNA(5 μl)電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA(5 μl)from young stem tissue in R.omeiensis Rolfe f.omeiensis

從平板上隨機挑取了10個單菌落，進行PCR擴增，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Trans2K Plus Π DNA Marker和菌落PCR產(chǎn)物點樣量均為5 μl。結(jié)果如圖2右所示:7號樣本在650～800 bp擴增到一條明顯的片段，與預(yù)擴增片段大小一致，切膠回收條帶清晰、效果良好，可用于測序。

2.3 Ro-DREB1C 序列分析

利用 Geneious5.6.3軟件分析 Ro-DREB1C基因，包含一個長度為603 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼200個氨基酸，數(shù)據(jù)已提交至 GenBank(登錄號:KX397104)。Ro-DREB1C與RhCBF基因編碼區(qū)的序列比對顯示:2個基因編碼區(qū)堿基序列相似度(Pairwise Identity)為96.5%，氨基酸序列相似度為95%，共檢查到21個潛在SNP，其中8個為潛在同義SNP位點，13個為潛在非同義SNP位點，共導(dǎo)致10個差異氨基酸。

2.4 Ro-DREB1C蛋白的理化性質(zhì)及一級結(jié)構(gòu)分析

用ProtParam軟件預(yù)測Ro-DREB1C蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示:此蛋白質(zhì)分子式為C968H1539N263O299S11，分子量 21 998.1D，理論等電點(pI)為6.75，說明該蛋白為弱酸性蛋白質(zhì);氨基酸殘基中絲氨酸 Ser(11.5%)、亮氨酸 Leu(11.0%)及丙氨酸Ala(9.5%)的頻率較高(圖4)，正負電荷氨基酸殘基數(shù)均為24;消光系數(shù)(M-1 cm-1 γ=280 nm)為29 575，其不穩(wěn)定系數(shù)為53.88，大于40，屬不穩(wěn)定類蛋白質(zhì)［15］。疏水指數(shù)為75.65，平均親水性為 －0.354，屬可溶性蛋白［16］。

圖2 以cDNA為模板的PCR產(chǎn)物(左)和菌落PCR產(chǎn)物(右)電泳圖Fig.2 Electrophoresis for PCR amplified fragment of cDNA template(left)and PCR amplified fragment of colony(right)

圖3 Ro-DREB1C和RhCBF的序列比對圖Fig.3 Sequence alignment between Ro-DREB1C and RhCBF

用ProtScale程序繪制Ro-DREB1C蛋白質(zhì)的親疏水性序列譜，窗口大小使用默認值9，圖形輸出顯示(圖5):該蛋白質(zhì)存在4個高分值，分別分布在30、102、134、174氨基酸位點附近;而5個低分值峰值位于 17、47、120、152、183 氨基酸位點附近，這些區(qū)域?qū)儆谟H水性。從ProtScale預(yù)測文本結(jié)果顯示，疏水性氨基酸(Score＞0)占38%，親水性氨基酸(Score＜0)占62%。

2.5 Ro-DREB1C亞細胞定位預(yù)測

利用PSORT II Prediction軟件對Ro-DREB1C的亞細胞定位進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，Ro-DREB1C在細胞核、線粒體、細胞質(zhì)、細胞骨架和高爾基體的分布比例分別為 47.8%、21.7%、17.4%、8.7%和4.3%，在細胞核中的分布最多。利用TMHMM和TMpred在線工具對Ro-DREB1C蛋白進行跨膜區(qū)分析，結(jié)果均顯示該蛋白無跨膜區(qū)。通過SignalP在線工具對信號肽分析顯示，該基因編碼的蛋白質(zhì)無信號肽序列存在。

2.6 Ro-DREB1C二、三級結(jié)構(gòu)分析

對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析有助于認識蛋白的空間結(jié)構(gòu)。選擇 PredictProtein軟件預(yù)測 Ro-DREB1C 的二級結(jié)構(gòu)，表明:α-螺旋占19.5%，β-折疊占9%，無規(guī)卷曲占71.5%。由于無規(guī)則卷曲所占比例超過50%，此蛋白不能被歸入明確的二級結(jié)構(gòu)如折疊片或螺旋的多肽區(qū)段［17］。

圖4 氨基酸組成Fig.4 Amino acid composition

運用CD-search工具分析Ro-DREB1C基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(圖6)，分析認為該蛋白屬于乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白AP2/EREBP(ethylene responsive element binding protein)，具有一個由61個氨基酸殘基組成的DNA結(jié)合域，可與啟動子區(qū)域中的GCC box特異結(jié)合。

結(jié)合同源建模軟件SWISS-MODEL和線串法(Threading)Phyre2在線軟件對Ro-DREB1C蛋白質(zhì)綜合建模，由建模輸出的數(shù)據(jù)可知:同源建模軟件SWISS-MODEL 在線搜索到模板1gcc.1.1，該模板和預(yù)測序列相似度為43%，建模位點范圍59～118，覆蓋率0.3，GMQE 值 0.19，偏低，代表此模型可信度低;線串法建模軟件 Phyre2在線搜索模型為d1gcca，模板和預(yù)測序列相似度為52.4%，建模位點范圍59～119，覆蓋度30.5%，可信度(confidence值)為99.9%。綜上所述，最終選用線串法分析結(jié)果，模型如圖7。

圖5 Ro-DREB1C氨基酸序列的疏/親水性預(yù)測Fig.5 Predicted hydrophobicity/hydrophily of the deduced amino acid sequence of Ro-DREB1C

圖6 Ro-DREB1C蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig.6 Analysis of conserved domain of Ro-DREB1C protein

圖7 Ro-DREB1C的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測建模Fig.7 The tertiary structure of Ro-DREB1C by Phyre2

圖8 月季CBF/DREB1蛋白相對于擬南芥DREB亞家族的進化分析Fig.8 Phylogenetic analysis of Ro-DREB1C among DREB subfamily in Arabidopsis thaliana

2.7 Ro-DREB1C的同源性分析

在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫中(https://www.arabidopsis.org/)，利用 BLAST 工具，對 Ro-DREB1C 的氨基酸序列進行BlastP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):匹配度最高的基因為DREB亞家族的CBF1/DREB1B和CBF2/DREB1C，Socre(bits)為120，E value分別為4×e－28、7×e－28。根據(jù)BlastP的搜索結(jié)果，選擇了A-1亞組(CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、DDF1、DDF2)和 A-2 亞 組 (AT3G11020、AT5G05410、AT1G75490、AT2G40340、AT2G40350)、A-4 亞組(AT2G36450、AT5G52020、AT1G01250、AT3G16280、AT5G25810)、A-5 壓組 (AT4G06746、AT2G23340、AT4G36900、AT3G50260、AT5G67190)、A-6 亞組(AT1G22190、AT1G78080、AT1G36060、AT1G64380、AT4G13620)。此外，還選取了已在月季中進行誘導(dǎo)表達或轉(zhuǎn)基因功能驗證的基因 RhCBF［7］、Rh-DREB1A 和 Rh-DREB1B［8］、MtDREB1C［9］。利用 MEGA7 軟件，選擇鄰位連接法(neighbor-joining，NJ)，對以上31個基因構(gòu)建進化樹(如圖8)。結(jié)果表明:擬南芥的各亞組成員分別聚為一類;Ro-DREB1C、Rh-DREB1A、Rh-DREB1B、RhCBF和MtDREB1C與擬南芥 A-1亞組成員聚為一類;A-1亞組中，Ro-DREB1C與RhCBF為同一個基因聚類在一起，Rh-DREB1A、Rh-DREB1B和MtDREB1C與擬南芥的DDF基因聚類在一起。

3 討論

有效鑒定和利用野生種質(zhì)資源的優(yōu)良基因或等位基因，通過優(yōu)良等位基因的累積提高植物育種的遺傳增益，是現(xiàn)代分子育種的熱點［18］。本研究利用克隆技術(shù)得到Ro-DREB1C基因，其同源性分析表明Ro-DREB1C屬于AP2家族DREB亞家族中的A-1亞組成員。擬南芥A-1亞組共有6個基因，薔薇或月季中A-1亞組的基因數(shù)還未知。分別對Rh-DREB1A、Rh-DREB1B、Ro-DREB1C 氨基酸序列進行比對，結(jié)果表明這3個基因之間的氨基酸序列相似度較低，在40% ～55%，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(圖8)的結(jié)果，推測Ro-DREB1C、Rh-DREB1A、Rh-DREB1B 為旁系同源，故將從峨眉薔薇克隆得到的DREB基因命名為Ro-DREB1C(‘Ro’為種的拉丁名縮寫)。野生的峨眉薔薇Ro-DREB1C與現(xiàn)代月季品種的Rh-CBF為直系同源，其CDS區(qū)的序列比對發(fā)現(xiàn)了21個SNP位點，無堿基的缺失或插入。其中有10個A/G、4個T/C之間發(fā)生轉(zhuǎn)換(transition)，3個A/C、2個A/T、1個G/C、1個C/T之間的顛換(transversion)。前人研究結(jié)果指出:從理論上分析，若單個堿基突變是隨機的，則SNP位點中顛換所占比例應(yīng)為轉(zhuǎn)換的2倍，但實際上SNP位點的產(chǎn)生多由單個堿基的轉(zhuǎn)換所引起［19］，本研究的結(jié)果與此相符?，F(xiàn)代月季品種形成過程中主要參與的野生種有8～10個［20］，峨眉薔薇不在其中，而Ro-DREB1C和RhCBF編碼區(qū)存在豐富的單核苷酸多樣性(SNP)，說明峨眉薔薇與現(xiàn)代月季品種間具有豐富的遺傳多樣性，因此認為峨眉薔薇可作為月季耐寒育種材料進行保存利用。

通過生物信息學(xué)分析軟件對Ro-DREB1C蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)分析，推測該蛋白質(zhì)為弱酸性、不穩(wěn)定類、親水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，β-折疊散布于其中，與擬南芥CBF2分析結(jié)果一致［21］。

4 結(jié)論

克隆了峨眉薔薇的一個CBF基因命名為Ro-DREB1C，分析了該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和二三級結(jié)構(gòu)，確認了隸屬于AP2家族DREB亞家族A-1亞組成員。此外，野生的峨眉薔薇Ro-DREB1C與現(xiàn)代月季品種的RhCBF比較，編碼區(qū)存在豐富的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，可作為優(yōu)秀的月季耐寒育種材料加以保存和利用。