馬繼瓊，孫一丁，楊 奕，李進斌，陳惠查，焦愛霞，譚金玉，阮仁超，許明輝*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南昆明 650223;2.云南省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205;3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所，貴州貴陽 550006)

【研究意義】稻瘟病是全世界范圍內(nèi)水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一。利用抗稻瘟病基因培育抗性品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟、有效、環(huán)保的手段。廣泛篩選鑒定抗稻瘟病基因資源是培育抗稻瘟病品種的基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】截至目前，已至少報道了69個抗稻瘟病位點共84個主效基因。其中，Pb1，Pia，Pib，Pid2，Pid3，Pik，Pikh，Pi54，Pik-p，Pish，Pit，Pita，Piz-t，Pi1，Pi2，Pi5，Pi9，Pi21，Pi25，Pi36，Pi37，Pi56，Pi63，PiCO39 等 24 個基因已被成功克隆［1］，為利用分子標記檢測這些基因提供了可能性。稻瘟病抗病基因Pikh是對稻瘟病菌具有廣譜抗性的主效抗病基因，如云南省檢測282個稻瘟病菌株的抗性已達81.7%［2］，廣東省163稻瘟病菌株的抗譜達 89.6%［3］，四川、貴州、重慶、福建、吉林等地也具有較強的稻瘟病抗性［4－6］，對病菌具有較寬的抗譜，在水稻抗病育種中有較大的利用價值。Pi9抗譜相當廣，檢測來自13個國家的43個稻瘟病菌株均表現(xiàn)出很高的抗性［7］;在云南及黑龍江等地的水稻育種上具有極高價值［2，8］，Abdullah 等建議推廣種植攜帶Pi9基因的水稻品種［9］。Pi2的抗譜也較廣，檢測出對792個中國收集的稻瘟小種中絕大部分均表現(xiàn)抗性［10］。Pi5則在溫室人工接種條件下對PO6-6等5個稻瘟病小種表現(xiàn)完全抗性［11］。

【本研究切入點】貴州禾類種質(zhì)資源是指原產(chǎn)貴州東南部(特別是從江、黎平、榕江、錦屏等縣)的一種地域性很強的特殊稻類生態(tài)型［12］，是在獨特的生態(tài)條件及當?shù)厣贁?shù)民族(侗族)特殊的耕作制度下，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選擇所形成的一種稻種，主要分布于林間深谷，其山林郁閉嚴重，霧多、濕度大，陽光直射時間短，氣候一日間寒熱變化頻繁，從而形成了與自然生態(tài)環(huán)境高度適應(yīng)的具有品質(zhì)優(yōu)良和抗逆性強為主要特點的稻種生態(tài)類型。具有耐陰性、耐冷性和苗期抗旱性極強等特點，并具有廣親和基因［13］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】文章利用Pikh、Pi2、Pi9、Pi5分子標記對貴州禾進行分析，明確每個地方品種攜帶這4個抗性基因的狀況，以評價貴州禾種質(zhì)資源利用價值，也將有助于制定新的稻瘟病防治與抗病育種策略。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料均為貴州省地方水稻品種“貴州禾”，共82份，來自貴州省黔東南和黔南2個州相互接壤的5個縣，其中從江縣39份、黎平縣28份、荔波縣9份、雷山縣4份、榕江縣2份。均為科技部科技基礎(chǔ)性工作專項“貴州農(nóng)業(yè)生物資源調(diào)查(2012FY110200)”調(diào)查隊2012－2015年調(diào)查中所收集的品種，目前民間仍有種植，感病對照為“麗江新團黑谷”。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成 PCR特異性引物參考文獻［14－16］，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列詳情見表1。

1.2.2 基因組總DNA提取 采用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.3 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系20 μl體系:Buffer 2 μl，dNTPs 1 μl，前后引物各 1 μl，Ex Taq 酶 0.4 μl，ddH2O 13.6 μl，DNA 模板 1 μl。反應(yīng)程序:95 ℃，5 min;95℃，40 s;57℃，30 s;72℃，50 s;41個循環(huán);72 ℃，10 min。

PCR擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，紫外燈下觀察拍照。

表1 目標基因引物及標記片段大小Table 1 Sequences of primers for target gene and expected fragment length

圖1 部分品種Pi9基因分子標記檢測Fig.1 Detection of Pi9 gene molecular markers in some varieties

1.2.4 葉稻瘟病田間抗性調(diào)查 2016－2017年材料種植于昆明市宜良縣(海拔1600 m)，屬稻瘟病嚴重稻區(qū)。順序排列，每個材料種植30株，感病對照為麗江新團黑谷，利用蒙古稻進行稻瘟病誘發(fā)。于7月上旬(封行期)進行葉稻瘟抗性調(diào)查，每個材料年度抗性級別有差異的以最高級別計。調(diào)查按《中華人民共和國國家標準GB/T15790-2009》品種抗性劃分標準葉瘟抗性分級指標進行調(diào)查分級:0級:高抗(HR)，無病;1級:抗(R)，只有針尖大小的褐點或稍大褐點;2級:中抗(MR)，圓形稍長的灰色小病斑，邊緣褐色，直徑1～2 mm;3級:中感1(MS1)，典型紡錘型病斑，長1～2 cm，通常局限于兩條主脈間，病斑面積2%以下;4級:中感2(MS2)，典型病斑，病斑面積2.1% ～10%;5級:感(S1)，典型病斑，病斑面積10.1% ～25%;6級:感(S2)，典型病斑，病斑面積25.1% ～50%;7級:高感1(HS1)，典型病斑，病斑面積50.1% ～75%;8級:高感2(HS2)，葉片全枯死。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻種資源稻瘟病抗性基因分子標記檢測

圖2 部分品種Pi2基因分子標記檢測Fig.2 Detection of Pi2 gene molecular markers in some varieties

圖3 部分品種Pikh基因分子標記檢測Fig.3 Detection of Pikh gene molecular markers in some varieties

利用特異引物對82份貴州水稻材料和麗江新團黑谷、蒙古稻基因組DNA進行了擴增，每個基因均能擴增出預期大小的條帶(圖1～4)，但有的品種不能擴增出相應(yīng)的條帶，很可能是該品種基因組引物結(jié)合位點發(fā)生了突變造成引物不匹配;Pi9有4個品種，Pikh和Pi5(圖4中4號樣)各有1個品種同時出現(xiàn)抗感條帶，說明這些品種在此位點是雜合的。

由表2可以看出，通過長期的人工和自然選擇，各稻瘟病抗性基因頻率不一，Pi5(32.35%)、Pikh(30.86%)相對較高，而 Pi9(2.56%)和 Pi2(2.47%)頻率較低。云南貴州地處同一高原，地方稻群體存在共同點，也存在差異。共同點是Pi9和Pi2在貴州禾和云南地方稻種頻率均較低，而云南Pi5和Pikh頻率分別為52.17%和65.22%，遠高于貴州相應(yīng)的基因頻率［17］。

這4個基因可以組合成0(不攜帶所檢測的任何基因)、Pikh、Pi5、Pi9、Pi5+Pikh、Pi2+Pi5、Pi9+Pi5等7種基因型，其比例分別是50%、21.95%、14.63%、1.22%、8.54%、2.44%、1.22%(表3)，41個品種(基因型0)不攜帶所檢測的任何1個基因，占50%，攜帶1個基因的品種(基因型Pikh、Pi5、Pi9)有 31 個(占 37.8%)，2 個基因(Pi5+Pikh、Pi2+Pi5 和 Pi9+Pi5)的有 10 個(占 12.2%)。

圖4 部分品種Pi5基因分子標記檢測Fig.4 Detection of Pi5 gene molecular markers in some varieties

表2 4個稻瘟病抗性基因頻率Table 2 Frequencies of four rice blast resistance genes

表3 4個稻瘟病抗性基因組合的基因型及在各縣的分布Table 3 Genotypes of four rice blast resistance genes and their distribution in each county

從表3還可以看出，從江、黎平、榕江、雷山4縣材料是典型的貴州禾，出現(xiàn) 0、Pikh、Pi5、Pi9、Pi5+Pikh和Pi9+Pi5共6種基因型，而Pi2+Pi5基因型只出現(xiàn)在荔波縣;從江縣61.54%品種屬于0型，0型為優(yōu)勢類型，黎平縣的材料0型(46.43%)和Pikh(42.86%)同為優(yōu)勢類型，雷山縣和榕江縣由于供試品種少，選材存在一定的偶然性不能判斷。荔波縣雖與從江縣接壤，供試品種少于從江縣和黎平縣，但基因型卻達到了6種，且沒有明顯的優(yōu)勢類型，多于從江縣(4種)和黎平縣(3種)，表明荔波縣品種相對豐富。同時印證了“貴州禾”的SSR多樣性程度較低的結(jié)果［18］。

2.2 稻種資源田間葉稻瘟抗性表現(xiàn)

在田間稻瘟病誘發(fā)試驗中，誘發(fā)品種蒙古稻嚴重發(fā)病(8級)，感病對照麗江新團黑谷田間表現(xiàn)感病(7級)，表明大田發(fā)病充分。82個品種中，46個品種對葉瘟表現(xiàn)高抗(0～1級)，占56.1%，其中黃鱔血(2013523309)、紅米(2014522141)2個品種表現(xiàn)高抗(0級)，表明貴州禾在云南宜良具有一定的抗性，這些品種分布在 0、Pikh、Pi5+Pikh、Pi5、Pi2+Pi5、Pi9+Pi5這6種基因型中(表4)。在品種數(shù)較多的0、Pikh、Pi5+Pikh和Pi5這4種基因型中，0型不攜帶所檢測的任何基因，抗性變異最大，變幅1～6級，有18個(43.9%)表現(xiàn)感病(3～6級)，平均抗性2.39級，而其他3種基因型變幅較小(1～3級)，都有部分品種表現(xiàn)中感(3級)，Pikh型有2個，Pi5+Pikh和Pi5型各有1個，3種基因型平均抗性分別為1.28、1.57 和1.17 級，抗性明顯高于不攜帶所檢測的任何基因的0型，表明田間抗性與所檢測的Pi5、Pikh基因有一定的關(guān)聯(lián)。Pikh和Pi5這2個基因在云南抗稻瘟病現(xiàn)代育種中起到了一定的作用，在現(xiàn)代育成品種中，70%品種攜帶Pikh，38.33%品種攜帶Pi5［17］，攜帶Pikh和Pi5的貴州禾在云南宜良表現(xiàn)一定的抗病性，進一步證明這2個基因在云南水稻生產(chǎn)中的有效性。

表4 各基因型稻瘟病抗性比較Table 4 Comparison of rice blast resistance among 7 genotypes

在0型品種中，雖不攜帶所檢測的任何一個抗性基因，但仍有15個品種在田間也表現(xiàn)出了高抗葉稻瘟，占36.59%，說明這些材料攜帶所檢測基因之外的抗性基因;也有少部分攜帶1～2個抗性基因的品種表現(xiàn)感病，如高粱糯通過檢測雖攜帶Pi9，但抗性為7級(高感)、占里糯禾攜帶Pi5+Pikh，抗性為3級(中感)，說明品種稻瘟病抗性的表達較為復雜，分子標記鑒定有一定的局限性。

3 討論

培育抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟有效的途徑之一，但稻瘟病抗性有非常強的小種?；?，且稻瘟病菌生理小種的多樣性和易變性，極易導致抗性品種喪失抗性?？沟疚敛∮N和品種布局中，育種家必須要清楚親本及后代品系攜帶的抗病基因種類和數(shù)量，指導品種的搭配和布局。然而傳統(tǒng)的抗病基因分析方法，需要大量的生理小種接種鑒定、抗性遺傳分析等工作，非常繁瑣。在資源研究中，由于資源數(shù)量大，要逐一進行接種鑒定工作量十分巨大，攜帶的抗性基因不清很大程度上影響了資源的利用。隨著水稻抗稻瘟病基因的克隆，抗性基因分子標記得到了快速的發(fā)展，大大提高抗病基因鑒定及育種選擇的效率，已成為抗病育種的一種簡單快捷的途徑?？沟疚敛』蚍肿訕擞浛蓽蚀_快速鑒定是否含有抗性基因，且具有操作簡便、用時短的優(yōu)點，可進行高通量的篩選，故近年來這一技術(shù)在國內(nèi)水稻育種和資源鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用［19－20］。

貴州地處云貴高原的東斜坡面，全境均屬山區(qū)，屬中國亞熱帶高原季風濕潤氣候。“天無三日晴”是對貴州多雨潮濕的生態(tài)條件最形象的描述，在這樣復雜的生態(tài)條件影響下，稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多樣性和復雜性。采用基因組重復序列PCR技術(shù)(rep-PCR)對貴州省的稻瘟病菌進行基因組指紋分析，黃培英等將200個供試菌株劃分為19個遺傳譜系［21］，姜于蘭等將154個供試菌株分為12個遺傳譜系，6個組群21個小種［22］。在這樣復雜的稻瘟病菌環(huán)境條件下，對57個主栽品種稻瘟病的田間抗性監(jiān)測表明56個對稻瘟病表現(xiàn)出不同程度的感病性，多數(shù)品種不抗稻瘟病或田間抗性表現(xiàn)較差［23］。曾令祥對來自貴州省79個縣(市)4 000余份地方品種接種鑒定表明抗稻瘟病種質(zhì)在貴州9個行政區(qū)域均有分布［24］。

Pi9基因來源于小粒野生稻(Oryza minuta)［25］，亞洲栽培稻(Oryza sativa)內(nèi)的Pi9基因是種間基因交流的結(jié)果。從分析結(jié)果看“貴州禾”中Pi9頻率較低，這與外來稻種基因交流少有關(guān)，仍保持其原始狀態(tài)，值得進一步研究，建議貴州抗稻瘟病育種中應(yīng)注意引入Pi9基因。

4 結(jié)論

貴州稻種資源以往的稻瘟病抗性研究均為田間和接種鑒定，本研究利用與 Pikh、Pi2、Pi9、Pi5稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標記對貴州禾攜帶的稻瘟病抗性基因進行分析，明確了各品種攜帶的基因種類和數(shù)量。Pikh、Pi5這2個基因在貴州禾中出現(xiàn)頻率較高，得到了廣泛保留和利用;田間抗性結(jié)果表明多數(shù)貴州禾對云南宜良的稻瘟病菌具有一定的抗性，攜帶1～2個抗性基因的品種一般均表現(xiàn)抗病，抗性與攜帶的基因有一定的關(guān)系。本研究結(jié)果也表明，部分不攜帶這4個基因的材料田間也表現(xiàn)高抗，表明這些材料還含有其他的抗性基因，所以在實踐中可利用分子標記進行基因的初步篩選，再配以傳統(tǒng)的接種鑒定和田間鑒定，才能準確地評價一個種質(zhì)。