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(1.西南科技大學(xué),四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心,四川綿陽(yáng) 621010; 2.綿陽(yáng)師范學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621006)

殼聚糖是經(jīng)甲殼素脫色、脫乙酰基后制備的天然生物大分子,是一種堿性、帶有正電荷的由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖組成的無(wú)分支二元多聚糖。由于其良好的安全性、成膜性、生物可降解性、生物相容性而被廣泛用作功能食品、食品添加劑、果蔬保鮮劑、飲料澄清劑[1-2],醫(yī)療上可作藥物載體、抗菌劑[3-4],同時(shí)可用于農(nóng)業(yè)、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化等諸多領(lǐng)域[5-7]。殼聚糖脫乙酰度值的大小直接影響其粘度、溶解能力、離子交換能力、免疫活性、絮凝性能、膜的伸張性大小和氨基有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)能力等性質(zhì)及開(kāi)發(fā)應(yīng)用[8]。因此,脫乙酰度是決定殼聚糖特定生理活性的重要參數(shù)之一,更是殼聚糖產(chǎn)品質(zhì)量判定的一個(gè)主要指標(biāo)。

現(xiàn)有的殼聚糖脫乙酰度測(cè)定方法較多,如紅外光譜法、紫外光譜法、色譜法、線性電位滴定法、雙突躍電位滴定法、酸堿滴定法、核磁共振法、庫(kù)倫滴定法、元素分析法等,這些方法各有優(yōu)劣,有的需要專(zhuān)門(mén)的儀器,所需成本高,但測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確,有的方法簡(jiǎn)單,操作方便,但測(cè)定精度較差[9-14]。同時(shí),課題組研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖的來(lái)源、粘度、分子量等因素對(duì)測(cè)定方法的選擇有較大影響,因此尋求一種簡(jiǎn)便快速、精密準(zhǔn)確、成本低廉、通用性高的分析方法成為分析工作者研究殼聚糖脫乙酰度測(cè)定的目標(biāo)。

本文首先比較了改良后的酸堿滴定法、線性電位滴定法、雙突躍電位滴定法、膠體滴定法、紫外光譜法、紅外光譜法六種常用測(cè)定方法,并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化,繼而采用不同來(lái)源與不同性質(zhì)的殼聚糖考察優(yōu)選方法的普適性,以期確定不同殼聚糖脫乙酰度測(cè)定方法的適用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖(標(biāo)示脫乙酰度:95.5%;分子量50000、100000;粘度76、60 mPa·s) 浙江金殼藥業(yè)有限公司;高粘度殼聚糖(>400 mPa·s) Sigma公司;蜣螂、土元、蟬蛻 成都荷花池藥材市場(chǎng);濃鹽酸、氫氧化鈉、甲基橙、亞甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、高錳酸鉀等試劑(均為分析純)、溴化鉀(優(yōu)級(jí)純)、聚乙烯硫酸鉀溶液 和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;N-乙酰-D-氨基葡萄糖 阿拉丁試劑。

HJ-4磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;PHS-3E型pH計(jì) 上海精科雷磁儀器廠;FA1104電子天平 上海精科;Alpha-1500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 改良酸堿滴定法 對(duì)于酸堿滴定法:精密稱(chēng)取標(biāo)示脫乙酰度為95.5%的殼聚糖樣品0.5 g,加0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液30 mL,置磁力攪拌器上攪拌至完全溶解,加入2～3滴甲基橙指示劑,溶液變?yōu)榧t色,用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定變成橙色,即為終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)顯示,滴定終點(diǎn)不易判斷,于是將甲基橙指示劑換為甲基橙-亞甲基藍(lán)[15-16],則滴定時(shí)溶液由紫色變?yōu)榈G色,便于觀察,即為改良酸堿滴定法。記錄消耗NaOH用量,用式(1)、式(2)計(jì)算脫乙酰度(DD)。

式(1)

式(2)

式中:C1,鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);C2,氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);V1,加入的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);V2,滴定耗用的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);G,樣品重(g);W,樣品的水分(%);0.016,與1 mL 1 mol/L的鹽酸溶液相當(dāng)?shù)陌被?9.94%,理論氨基含量。

1.2.2 雙突躍電位滴定法 精密稱(chēng)取0.2 g干燥至恒重的標(biāo)示脫乙酰度為95.5%的殼聚糖樣品,置于50 mL燒杯中,加入20 mL 0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液,室溫下磁力攪拌使其完全溶解,再加入30 mL蒸餾水。將pH電極放入樣品溶液中,用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,記錄原pH及加入不同體積NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液后被滴定液的pH,以溶液的pH對(duì)NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定體積作圖,即得到酸堿滴定曲線,做pH對(duì)VNaOH的一級(jí)微商曲線,得到雙突躍滴定曲線[17],按式(3)計(jì)算殼聚糖脫乙酰度。

式(3)

式中:n=C×(V2-V1);C,NaOH的濃度(mol/L);V1,第一突躍點(diǎn)時(shí)用去的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(L);V2,第二突躍點(diǎn)時(shí)用去的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(L);G,樣品重(g)。

1.2.3 線性電位滴定法 精密稱(chēng)取標(biāo)示脫乙酰度為95.5%的0.25 g殼聚糖,加入0.1 mol/L的HCl 20 mL,于磁力攪拌器上攪拌至殼聚糖完全溶解。加入10 mL蒸餾水,攪拌均勻,加入2～3滴甲基橙指示劑,攪拌均勻。用0.1 mol/L NaOH滴定,前2～4 mL NaOH滴加后,不記錄pH,以后每滴加1 mL NaOH,攪拌均勻后,記錄甲基橙指示劑變?yōu)辄S色前的4個(gè)pH,將每個(gè)pH對(duì)應(yīng)的氫氧化鈉溶液的體積(v)代入函數(shù)式(4)。

式(4)

式中:f(v),電位滴定時(shí),體積與電位的函數(shù)關(guān)系;V0,鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積加上稀釋用蒸餾水的體積(mL);V,氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);NB,氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);[H+],H+的濃度(mol/L);[OH-],OH-的濃度(mol/L)。

計(jì)算f(v),以f(v)為縱坐標(biāo),V為橫坐標(biāo)作圖,以直線外推與橫坐標(biāo)相交點(diǎn)的橫坐標(biāo)值為所用的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(Ve),按式(5)計(jì)算殼聚糖的脫乙酰度[18]。

式(5)

式中:C1,鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);C2,氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);V1,加入的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);m,樣品重(mg);161,殼聚糖中氨基葡萄糖的鏈節(jié)分子量。

表1 改良后的酸堿滴定法測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of improved acid-base titration

式(6)

式中:NPVSK,PVSK的當(dāng)量濃度(g/L);M殼,殼聚糖的鏈節(jié)分子量161.15;ΔV,消耗PVSK的體積差V1-V2(L);C,殼聚糖溶液的濃度(g/mL)。

1.2.5 紫外光譜法 以0.001 mol/L HCl為溶劑,用0.1 mg/mL N-乙酰葡萄糖胺配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以0.001 mol/L HCl為參比液,在203 nm處測(cè)定系列溶液的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱(chēng)20 mg標(biāo)示脫乙酰度為95.5%的殼聚糖樣品于100 mL量瓶中,加入10 mL 0.01 mol/L鹽酸溶解后,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,以0.01 mol/L鹽酸作為參比液,測(cè)定其在203 nm處的吸光度,從工作曲線中得到樣品中乙?；臐舛萚20],按式(7)計(jì)算脫乙酰度。

式(7)

式中:C乙?；?樣品中乙酰基的濃度(mg/mL);C樣,殼聚糖樣品濃度(mg/mL)。

式(8)

1.2.7 自制殼聚糖的制備 將蜣螂、土鱉蟲(chóng)、蟬蛻分別粉碎,取適量,加入1.3 mol/L HCl進(jìn)行脫礦,繼而加入4 mol/L NaOH溶液脫蛋白,收集殘?jiān)?去離子水洗至中性,50 ℃干燥12 h后先后加入3%高錳酸鉀溶液與2%草酸溶液進(jìn)行脫色,而后加入20 mol/L的NaOH溶液脫乙酰,50 ℃干燥12 h即得自制殼聚糖[22]。

1.2.8 通用性檢測(cè) 通過(guò)比較上述幾種脫乙酰度測(cè)定方法,篩選出準(zhǔn)確度與精密度較高的方法,分別以高分子量(150000)、低分子量殼聚糖(50000)、高粘度(400 mPa·s)、中粘度(200 mPa·s)、低粘度殼聚糖(60 mPa·s)、自制殼聚糖為考察對(duì)象,進(jìn)行通用性檢測(cè),從而考察不同測(cè)定方法對(duì)不同分子量、不同粘度、不同來(lái)源殼聚糖的適用性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每種方法做3次平行,結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,以樣品標(biāo)示脫乙酰度為真實(shí)值,精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)衡量,準(zhǔn)確度的計(jì)算如式(9)、式(10)、式(11)所示。

偏差=|脫乙酰度計(jì)算值-樣品標(biāo)示脫乙酰度|

式(9)

式(10)

式(11)

2 結(jié)果與分析

2.1 改良酸堿滴定法

由表2可知:市購(gòu)殼聚糖的脫乙酰度為98.35%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.33%。以標(biāo)示值為殼聚糖真實(shí)值,計(jì)算得準(zhǔn)確度為97.01%。利用殼聚糖的自由氨基呈堿性,可與酸定量的發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng),形成殼聚糖的膠體溶液,以指示劑顏色變化為判定依據(jù),確定滴定終點(diǎn),得堿消耗量,使用甲基橙-亞甲基藍(lán)指示劑進(jìn)行滴定,改善了單用甲基橙作為指示劑的顯色反應(yīng)不明顯的問(wèn)題,提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

2.2 雙突躍電位滴定法

從圖1、圖2可知,用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定殼聚糖時(shí),明顯存在兩個(gè)滴定突躍點(diǎn),第一個(gè)突躍點(diǎn)范圍在pH為2～4之間,第二個(gè)滴定突躍的范圍在pH為6～8之間。前一突躍對(duì)應(yīng)NaOH中和溶液中過(guò)量HCl的過(guò)程,后一突躍對(duì)應(yīng)NaOH中和質(zhì)子化胺基的過(guò)程,反映滴定終點(diǎn)前后的情況。計(jì)算得殼聚糖脫乙酰度為76.92%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%,該結(jié)果與殼聚糖脫乙酰度標(biāo)示值相差較大,準(zhǔn)確度僅為80.55%,其原因可能是當(dāng)樣品溶液滴定至弱酸性時(shí),殼聚糖沉淀逐漸析出,并粘附于玻璃電極的膜表面,導(dǎo)致溶液越來(lái)越渾濁與粘稠,從而嚴(yán)重干擾電極對(duì)溶液H+活度的響應(yīng),影響測(cè)定,同時(shí)延長(zhǎng)了測(cè)定時(shí)間[23]。

圖1 殼聚糖脫乙酰度的滴定曲線Fig.1 Titration curve of deacetylation degree of chitosan

圖2 一級(jí)微商曲線Fig.2 First-order derivative curve

2.3 線性電位滴定法

由表2所得數(shù)據(jù),以f(v)為縱坐標(biāo),滴定消耗NaOH溶液V(mL)為橫坐標(biāo)作圖,如圖3,回歸方程為:y=-2.3168x+14.988,R2=0.9994,表明線性關(guān)系良好,以直線外推與橫坐標(biāo)相交點(diǎn)的橫坐標(biāo)值為所用的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,結(jié)果如表3所示。

表2 線性電位滴定法的V-f(V)Table 2 V-f(V)of linear potentiometric titration

表3 線性電位滴定法測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of linear potentiometric titration

表4 膠體滴定法測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of colloidal titration

圖3 線性電位滴定法滴定曲線Fig.3 Linear potentiometric titration curve

計(jì)算得樣品的脫乙酰度為87.35%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.48%。由測(cè)定結(jié)果可知，線性電位滴定法準(zhǔn)確度較高,重復(fù)性好,其原因是線性電位滴定法只需測(cè)定滴定終點(diǎn)前的4～5組數(shù)據(jù),繪圖外推即可得到滴定終點(diǎn)時(shí)所消耗的氫氧化鈉用量,避免析出的殼聚糖干擾測(cè)定,影響滴定終點(diǎn)的判斷,減少了因確定終點(diǎn)而引起的誤差。

2.4 膠體滴定法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:殼聚糖脫乙酰度為84.15%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.36%。由結(jié)果可知，該方法的計(jì)算偏差較大,該方法易受到指示劑用量、溶液pH、滴定速度與離子強(qiáng)度等因素的影響[24],指示劑滴加過(guò)多,待測(cè)溶液變?yōu)樯钏{(lán)色,當(dāng)?shù)味ㄖ晾碚摻K點(diǎn),溶液變色不明顯,滴定終點(diǎn)判斷滯后,造成測(cè)定偏差,滴定速度受氫離子電力速度限制,滴定過(guò)快,正負(fù)離子間來(lái)不及締合,滴定的PVSK與指示劑作用變色,導(dǎo)致滴定終點(diǎn)判斷提前,滴定過(guò)慢,溶液出現(xiàn)返色,均導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)較大誤差。

2.5 紫外光譜法

以等梯度濃度的N-乙酰-D-氨基葡萄糖溶液在203 nm處的吸光度(A)與濃度(mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=13.51x,R2=0.9975,表明線性關(guān)系良好。計(jì)算得到殼聚糖脫乙酰度為88.34%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66%,由表5可知測(cè)得的脫乙酰度值較真實(shí)值偏低,主要原因是D-氨基葡萄糖在203 nm處影響N-乙?；?D-葡萄糖胺溶液吸光度的測(cè)定,使得吸光度偏大,樣品中乙酰基濃度偏大,測(cè)得脫乙酰度偏低,另外,樣品中含有的少量不溶性雜質(zhì)也影響測(cè)定[24]。

表5 紫外光譜法測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of UV spectroscopy

2.6 紅外光譜法

樣品的紅外光譜如圖4。

圖4 殼聚糖紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of chitosan

計(jì)算得到樣品的脫乙酰度為80.22%,與真實(shí)值相差較大,準(zhǔn)確度為85.75%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.86%,由于不同脫乙酰度,殼聚糖分子中酰胺基團(tuán)參與形成的鏈內(nèi)、鏈間氫鍵的數(shù)目均不同,酰胺峰的位置也將受到影響,且該方法對(duì)殼聚糖樣品處理的要求較高,樣品處理的好壞直接影響到測(cè)定結(jié)果,導(dǎo)致該方法可重復(fù)性低,操作難度大,技術(shù)要求高,需要特殊儀器。

2.7 六種方法的綜合評(píng)價(jià)

從測(cè)定方法的準(zhǔn)確度、精密度、簡(jiǎn)便性、耗時(shí)幾方面對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),如表6所示。

表6 不同測(cè)定方法綜合評(píng)價(jià)Table 6 Comprehensive evaluation of different measurement methods

結(jié)果顯示:改良酸堿滴定法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度,操作簡(jiǎn)單,不需特殊儀器,準(zhǔn)確度與精密度高;雙突躍滴定法取點(diǎn)多,接近終點(diǎn)時(shí),析出的殼聚糖可影響pH及時(shí)準(zhǔn)確的測(cè)定,滴定耗時(shí)長(zhǎng),操作繁瑣,測(cè)定準(zhǔn)確度較低;線性電位滴定法在滴定時(shí)取點(diǎn)少,較雙突躍滴定方便省時(shí);膠體滴定法對(duì)滴定速度控制嚴(yán)格,速度過(guò)快,不利于正負(fù)電荷的締合反應(yīng),速度過(guò)慢,溶液有返色現(xiàn)象;紅外光譜法、紫外光譜法均需要特殊儀器,其中紅外光譜法操作步驟簡(jiǎn)單,但對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技能要求較高,而紫外光譜法測(cè)定脫乙酰度影響因素少,測(cè)定值客觀準(zhǔn)確,精密度較好,測(cè)定時(shí)所需樣品量少,但測(cè)定對(duì)照用標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格較高。綜上,改良酸堿滴定法、線性電位滴定法、紫外光譜法的測(cè)定準(zhǔn)確度、精密度均較高。

2.8 通用性

針對(duì)不同來(lái)源、不同分子量、不同粘度的殼聚糖,對(duì)優(yōu)選的改良酸堿滴定法、線性電位滴定法、紫外光譜法三種方法的通用性進(jìn)行考察,結(jié)果如表7所示。

表7 不同殼聚糖脫乙酰度測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of degree of deacetylation of different chitosan

由表7可知,上述三種方法通用性均較好,適用于大部分不同類(lèi)型的殼聚糖。因低分子量(≤100000)的殼聚糖溶解后為黃色,滴加指示劑后溶液顏色受殼聚糖顏色影響,無(wú)法判定滴定終點(diǎn),故無(wú)法采用酸堿滴定法及線性電位滴定法,應(yīng)采用紫外光譜法,而高粘度(≥400 mPa·s)的殼聚糖脫乙酰度測(cè)定可采用線性電位滴定法,其余殼聚糖脫乙酰度測(cè)定均可使用改良后的酸堿滴定法,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高,且所需儀器簡(jiǎn)單、成本低。

3 結(jié)論

紅外光譜法對(duì)儀器和樣品處理要求高,雙突躍電位滴定法耗時(shí)長(zhǎng),膠體滴定法重現(xiàn)性差,且上述三種方法準(zhǔn)確度較低,故非脫乙酰度測(cè)定的優(yōu)選方法,而改良酸堿滴定法、線性電位滴定法、紫外光譜法的精密度與準(zhǔn)確度均較高,且從通用性考察來(lái)看,改良酸堿滴定法、線性電位滴定法、紫外光譜法的通用性均較好,綜合考慮,改良酸堿滴定法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高,且所需儀器簡(jiǎn)單、成本低,是脫乙酰度測(cè)定的優(yōu)選法,但該方法不能測(cè)定低分子量、高粘度殼聚糖,對(duì)于低分子量(≤100000)殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定建議采用紫外光譜法,而高粘度(≥400 mPa·s)殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定可采用線性電位滴定法。