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(1.無(wú)限極(中國(guó))有限公司,廣東江門 529156; 2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 3.江西省獸藥飼料監(jiān)察所,江西南昌 330047)

黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,以二呋喃環(huán)和香豆素為基本結(jié)構(gòu),具有強(qiáng)烈的致癌性和毒性,1993年被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物,其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的致癌性和毒性最強(qiáng),主要危害人和動(dòng)物的肝臟[1]。目前,玉米、小麥等糧食作物中的AFB1的污染已受到廣泛的關(guān)注[2],并已制定相應(yīng)的國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。同時(shí)決明子等藥食同源的種子類作物受AFB1污染的情況也逐漸得到重視[5],很多國(guó)家制定了相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。韓國(guó)決明子中AFB1最高限量為10 ng/g[6],意大利設(shè)定的最高限量則為5 ng/g[7]。因此,針對(duì)決明子中AFB1快速檢測(cè)方法的建立具有前瞻性和必要性。

目前,傳統(tǒng)的AFB1的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[8-9]和酶聯(lián)免疫吸附法[10-11]等。這些方法的靈敏度高,重現(xiàn)性好,但樣品的前處理比較復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng),需要專業(yè)人員操作和特定的儀器設(shè)備,不適合大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)篩查。

免疫層析法是近年來(lái)迅速發(fā)展的一項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù),具有簡(jiǎn)便、高效、成本低、污染小等特點(diǎn),非常適合于大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)篩查[12]。免疫層析法有多種標(biāo)記物可供選擇,目前最常用的是膠體金納米粒子(AuNP)[13]和熒光微球納米粒子(Fitc@PS)[14]。膠體金納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性,能夠被長(zhǎng)期保存,可以依靠肉眼對(duì)信號(hào)進(jìn)行讀取識(shí)別,達(dá)到可視化檢測(cè)的目的[15]。但熒光微球比膠體金具有更高的信號(hào)值,更寬的線性范圍,更好的批間重復(fù)性[16],適合于待檢物的定量檢測(cè)。

本研究以Fitc@PS制備免疫探針,旨在建立針對(duì)決明子中AFB1的定量免疫層析快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熒光微球(激發(fā)波長(zhǎng)為470 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm,Fitc@PS) 美國(guó)Ocean Nanotech;AFB1檢測(cè)抗原(AFB1-BSA)、AFB1單克隆抗體 本實(shí)驗(yàn)室制備;羊抗鼠二抗 艾美捷科技有限公司;AFB1標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品、赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品、T2毒素標(biāo)準(zhǔn)品、伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白(BSA)和乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 美國(guó)Sigma公司;其它試劑 均為分析純。

BG-12 C超聲儀 廣州邦潔電子產(chǎn)品有限公司;HGS510劃膜噴金機(jī)、HGS-201可編程切條機(jī)和熒光微球試紙條讀取儀 杭州峰航科學(xué)儀器有限公司;TGL-16型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;硝酸纖維膜(NC膜) 德國(guó)Sartorius公司;聚酯膜(濾紙)、樣本墊、結(jié)合墊、吸水紙和PVC底板 上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Fitc@PS免疫探針及免疫層析試紙條的制備 用0.2 mol/L的Na2CO3溶液或1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)0.7 mL PB緩沖液(0.01 mol/L)pH至一定值,加入12 μL熒光微球(0.12 mg),混勻超聲2 min(600 W,40 kHz)后分別加入100 μL EDC(0.05 mg/mL)和一定濃度的100 μL AFB1單克隆抗體溶液,室溫反應(yīng)30 min 后再加入100 μL EDC(0.05 mg/mL),繼續(xù)室溫反應(yīng)30 min,加入111 μL 10%(w/v)BSA溶液及100 μL EDC(0.1 mg/mL),封閉120 min。4 ℃、13500 r/min離心15 min,棄上清,以200 μL復(fù)溶液(0.01 mol/L PBS、5%蔗糖、2%果糖、1% PEG-20000、1% BSA、0.4% Tween-20)重懸沉淀[17]。

用HGS510劃膜噴金機(jī)在NC膜上噴涂一定濃度的AFB1-BSA(0.74 μL/cm)和羊抗鼠二抗(0.9 mg/mL,0.74 μL/cm),分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線),在結(jié)合墊上噴涂Fitc@PS免疫探針。將濾紙、樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水紙按順序貼于PVC底板上,切成3.9 mm寬的試紙條。制備好的試紙條置于密封袋中,干燥陰涼條件下保存。

1.2.2 Fitc@PS及Fitc@PS-mAb復(fù)合物的表征 通過(guò)掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)對(duì)Fitc@PS進(jìn)行表征。通過(guò)粒度儀對(duì)Fitc@PS及Fitc@PS-mAb復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic light scattering,DLS)分析,表征AFB1抗體是否成功標(biāo)記于Fitc@PS上。

1.2.3 抑制率的測(cè)定 采用熒光微球試紙條讀取儀分別讀取熒光微球試紙條上T線和C線的熒光信號(hào)值,計(jì)算抑制率。抑制率=1-BX/B0,BX為陽(yáng)性樣本T線和C線信號(hào)強(qiáng)度的比值,B0為陰性樣本T線和C線信號(hào)強(qiáng)度的比值。

1.2.4 熒光微球試紙條的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 標(biāo)記pH的選擇 將PB緩沖液的pH分別調(diào)整為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,在此條件下將Fitc@PS與60 μg/mg的AFB1單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián),制備Fitc@PS免疫探針。通過(guò)熒光微球試紙條(T線上AFB1-BSA的濃度為0.8 mg/mL)讀取儀讀取T線和C線的熒光信號(hào)值,根據(jù)抑制率,比較五個(gè)不同標(biāo)記pH下,Fitc@PS與AFB1單克隆抗體的偶聯(lián)結(jié)果。

1.2.4.2 抗體標(biāo)記量的選擇 在最佳標(biāo)記pH下,分別選取30、40、50、60和70 μg/mg五個(gè)抗體標(biāo)記量進(jìn)行Fitc@PS免疫探針的制備。比較不同抗體標(biāo)記量下,檢測(cè)線(T線)信號(hào)強(qiáng)度和質(zhì)控線(C線)信號(hào)強(qiáng)度的比值(T/C值)和抑制率的結(jié)果。

1.2.4.3 AFB1-BSA濃度的選擇 在最佳標(biāo)記pH以及最佳抗體標(biāo)記量下,分別將0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的AFB1-BSA噴在NC膜上作為檢測(cè)抗原。比較不同AFB1-BSA濃度下,T/C值和抑制率的結(jié)果。

1.2.5 免疫層析試紙條的檢測(cè)步驟 將決明子樣本粉碎,過(guò)18目篩,準(zhǔn)確稱取1 g,用純甲醇進(jìn)行提取,振蕩3 min,4 ℃、4000 r/min離心10 min,取上清,用0.01 mol/L PBS溶液(pH7.4)稀釋到甲醇終濃度為20%,取100 μL試樣滴加于試紙條樣本墊上。

如圖1所示,反應(yīng)20 min 后,熒光微球免疫層析試紙條經(jīng)熒光微球試紙條讀取儀讀取T/C值,通過(guò)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行定量檢測(cè)。

圖1 黃曲霉毒素B1免疫層析試紙條檢測(cè)原理圖 Fig.1 Schematic diagram of lateral flow strip for the detection of AFB1

1.2.6 熒光微球免疫層析試紙條的評(píng)價(jià)

1.2.6.1 靈敏度評(píng)價(jià) 以AFB1濃度為X軸,BX/B0為Y軸繪制熒光免疫層析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線。在經(jīng)UPLC確證為陰性樣本的決明子提取液(提取方法同1.2.5)中加標(biāo):0、0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 ng/mL,每個(gè)濃度梯度進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn),靈敏度通過(guò)陰性樣本的平均值減三倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算[18]。

1.2.6.2 特異性評(píng)價(jià) PBS緩沖液中分別加入黃曲霉毒素B1(AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素A(OTA)、T2毒素、伏馬毒素B1(FB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN),配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液,其中AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為1 ng/mL,其它標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度均為100 ng/mL。用本實(shí)驗(yàn)所建立的免疫層析檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)條件重復(fù)三次。

1.2.6.3 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 參照本方法的線性范圍,陰性決明子樣本加標(biāo)0、1、2.5、5、10 ng/g后,用本實(shí)驗(yàn)所建立的免疫層析方法進(jìn)行檢測(cè),并將結(jié)果與UPLC方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)所建立檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fitc@PS及Fitc@PS-mAb復(fù)合物表征

掃描電鏡圖像顯示Fitc@PS粒徑均一,分散均勻,平均直徑為340 nm(圖2)。Fitc@PS-mAb復(fù)合物中的抗體是通過(guò)氨基與Fitc@PS微球表面經(jīng)EDC活化的羧基作用實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的。動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果顯示(圖3),Fitc@PS的平均水化粒徑為302 nm,而標(biāo)記抗體后平均水化粒徑增大至324 nm,表明AFB1單克隆抗體成功與Fitc@PS偶聯(lián)。

圖2 Fitc@PS掃描電鏡圖像Fig.2 SEM images of Fitc@PS

圖3 Fitc@PS及Fitc@PS-mAb復(fù)合物的動(dòng)態(tài)光散射分析Fig.3 DLS analysis of Fitc@PS and Fitc@PS-mAb complex

2.2 免疫層析試紙條的優(yōu)化

2.2.1 標(biāo)記pH的優(yōu)化 在不同的pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)下,抗體的活性及抗體與標(biāo)記物的結(jié)合效率不同[19]。如圖4A,在Fitc@PS標(biāo)記抗體中,不同pH下,陰性T線熒光信號(hào)值差異顯著(p<0.05)。當(dāng)pH為7時(shí),T線陰性信號(hào)值最大,因此最佳pH為7。

2.2.2 抗體標(biāo)記量的優(yōu)化 在最佳標(biāo)記pH下,研究了抗體標(biāo)記量對(duì)免疫層析的影響。如圖4B,在Fitc@PS免疫層析系統(tǒng)中,不同抗體標(biāo)記量下,陰性T/C值差異顯著(p<0.05)。當(dāng)抗體標(biāo)記量為60 μg/mg時(shí),陰性T/C最大,因此最佳抗體標(biāo)記量為60 μg/mg。

2.2.3 AFB1-BSA濃度的優(yōu)化 如圖4C,在Fitc@PS免疫層析系統(tǒng)中,在不同AFB1-BSA濃度下,陰性T/C值在四個(gè)水平的AFB1-BSA濃度間(0.6、0.8、1.0和1.2 mg/mL)差異顯著(p<0.05)。當(dāng)AFB1-BSA濃度為0.8 mg/mL時(shí)有合適的T/C值(T/C值為1.78,T/C值過(guò)高會(huì)導(dǎo)致高的CV值,T/C值過(guò)低會(huì)導(dǎo)致線性范圍變窄),因此最佳檢測(cè)抗原濃度為0.8 mg/mL。

圖4 熒光微球免疫層析試紙條的單因素實(shí)驗(yàn)Fig.4 Single factor experiment of fluorescent microsphere lateral flow strip注:圖中不同小寫字母表示在p<0.05水平上差異顯著。

2.3 免疫層析試紙條的評(píng)價(jià)

2.3.1 靈敏度評(píng)價(jià) 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示,通過(guò)線性擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及相應(yīng)的線性范圍,a為低濃度曲線,線性范圍為0.1～0.6 ng/mL,線性方程為y=-0.5854 log(x)+0.09948,R2=0.9846;b為高濃度曲線,線性范圍為0.6～2.0 ng/mL,線性方程為y= -0.2234 log(x)+0.1654,R2=0.9888。其中,x為溶液中的AFB1濃度,y為BX/B0值,靈敏度為0.034 ng/mL。

圖5 AFB1熒光微球免疫層析試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Calibration curve of the fluorescence microsphere lateral flow strip to quantitatively detect AFB1注：a:低濃度標(biāo)曲;b:高濃度標(biāo)曲。

2.3.2 特異性評(píng)價(jià) 特異性結(jié)果顯示，F(xiàn)itc@PS免疫層析試紙條有很好的特異性。如圖6,只有在AFB1的加標(biāo)檢測(cè)中產(chǎn)生了明顯的抑制。其中,BX為加標(biāo)樣本T線和C線的信號(hào)強(qiáng)度比值,B0為陰性緩沖液T線和C線的信號(hào)強(qiáng)度比值。

圖6 免疫層析試紙條特異性Fig.6 Specificity of the lateral flow strip注：a:陰性;b:黃曲霉毒素B1;c:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;d:赭曲霉毒素A;e:T2毒素;f:伏馬毒素B1;g:玉米赤霉烯酮。

2.3.3 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià) 將熒光微球免疫層析法對(duì)加標(biāo)決明子樣本的檢測(cè)結(jié)果與UPLC的檢測(cè)結(jié)果繪制線性相關(guān)曲線,結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性很好(圖7),R2為0.9963。因此本文所建立的熒光微球免疫層析法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖7 熒光微球免疫層析試紙條與UPLC檢測(cè)決明子中AFB1結(jié)果相關(guān)性Fig.7 Correlation of AFB1 assay between the fluorescence microsphere lateral flow strip and UPLC method in Semen cassiae samples

3 結(jié)論

本研究以Fitc@PS為標(biāo)記物,成功建立了針對(duì)決明子基質(zhì)中AFB1的熒光微球免疫層析試紙條定量檢測(cè)方法。方法靈敏度為0.034 ng/mL,具有良好的特異性,且與UPLC的檢測(cè)結(jié)果一致,可以滿足現(xiàn)場(chǎng)大批量決明子樣本中AFB1快速、準(zhǔn)確和定量檢測(cè)的需求。