,,,,2,*

(1.玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院,廣西玉林 537000; 2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西玉林 537000)

天然植物多糖具有抗炎、抗氧化[1]、增強(qiáng)免疫[2]、抗病毒[3]、防衰老[4]等多種藥理作用,且毒副作用低,越來(lái)越受到學(xué)者的重視[5]。植物多糖可作為食品和藥品的有效添加成分,藥食兩用植物多糖系列產(chǎn)品的市場(chǎng)前景將非常廣闊[6]。天然產(chǎn)物多糖來(lái)自于植物細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁的天然高分子化合物,可采用有機(jī)溶劑、酶解等方法提取,其中酶解提取操作簡(jiǎn)單、條件較溫和,在多糖結(jié)構(gòu)研究以及活性保持方面具有一定的優(yōu)勢(shì)[7]。

地桃花(UrenalobataL.)又稱肖梵天花、假桃花、野棉花等,屬于錦葵科植物,主要產(chǎn)于廣西、四川及貴州等地,富含多種藥效成分如多糖類、黃酮類、苷類、香豆素、木脂素以及蛋白質(zhì)[8-10]。研究報(bào)道地桃花提取物具有明顯的抗炎、抗菌及抗氧化等藥理活性[11-13]。地桃花可清熱解毒、祛風(fēng)利濕及活血消腫,用于治療感冒、痢疾等疾病,是中成藥花紅片生產(chǎn)的原料成分之一[14],對(duì)其有效成分多糖的研發(fā)將有助于提升其藥食兩用價(jià)值。目前有關(guān)地桃花單一成分提取及其生物活性的研究報(bào)道很少,針對(duì)多糖成分,僅見(jiàn)藍(lán)峻峰等采用超聲波輔助半仿生法提取,結(jié)果表明,在液料比30∶1、超聲功率60 W、提取溫度75 ℃、提取時(shí)間50 min的條件下,地桃花多糖得率為12.86%[14],此工藝相比酶法具有提取溫度高、需要超聲設(shè)備、工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。為了解地桃花多糖生物活性及優(yōu)化其提取工藝,本文研究了纖維素酶提取地桃花多糖的最佳條件,并探討其體外抗氧化活性,為地桃花多糖進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及抗氧化活性的深入研究提供一定的科技支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地桃花采自廣西容縣,經(jīng)陳曉白教授鑒定為錦葵科梵天花屬地桃花干燥全草;纖維素酶(食品級(jí),5萬(wàn)U/g)、維生素C、D-無(wú)水葡萄糖 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 購(gòu)自日本TCI公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

5810R型高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf;Alpha-1506型紫外分光光度計(jì) 上海譜元儀器;SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器 常州華普達(dá)教學(xué)儀器;PHS-25型pH計(jì) 上海雷磁;SHB-III型循環(huán)水真空泵、2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海皓莊儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 地桃花多糖的提取 地桃花全草自然晾干,精確稱取5.0 g粉碎并過(guò)100目篩后的地桃花粉,按設(shè)定酶解條件(pH、液料比、酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度),在180 r/min搖床上進(jìn)行酶解提取實(shí)驗(yàn),得到多糖浸提液。多糖浸提液經(jīng)90 ℃高溫滅活、6000 r/min離心分離10 min、抽濾、濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80 ℃濃縮至1/10、乙醇沉淀、Sevag法除蛋白、透析除雜、乙醇二次沉淀、真空冷凍干燥(溫度-55 ℃,壓力0.05 MPa)一系列步驟[15],最終獲得地桃花多糖。

1.2.2 地桃花多糖含量的測(cè)定 多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法[16],葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.4986x-0.0185,R2=0.9903,式中y為490 nm條件下的吸光度值,x為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)。多糖得率計(jì)算公式如下:

多糖得率(%)=cnV/m×100

式中,c為樣品稀釋液中多糖的濃度(mg/mL),n為稀釋倍數(shù),V為樣品稀釋液體積(mL),m為地桃花粉質(zhì)量(mg)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 酶解時(shí)搖床轉(zhuǎn)速固定為180 r/min,分別考察pH(3.0、4.0、5.0、6.0)、液料比(4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1 mL/g)、酶添加量(2、6、10、14、18 mg/mL)、酶解時(shí)間(40、80、120、160、200 min)和酶解溫度(35、45、55、65 ℃)對(duì)地桃花多糖得率的影響,其中各因素固定水平為pH5.0、液料比8∶1 mL/g、酶添加量10 mg/mL、酶解時(shí)間80 min、酶解溫度45 ℃。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,自變量包括液料比、酶解時(shí)間、酶添加量、酶解溫度四個(gè)因素,以多糖得率為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)與水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 地桃花多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 取不同質(zhì)量濃度的地桃花多糖溶液2 mL和2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)混勻,反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度A1,同法測(cè)定2.0 mL乙醇加樣液的吸光度A2,以及2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL蒸餾水的吸光度A0,以維生素C作為對(duì)照,樣品對(duì)DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100[15]。

1.2.5.2 ·OH的清除能力測(cè)定 取不同質(zhì)量濃度的地桃花多糖溶液2 mL,依次加入濃度均為5 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2 mL,混勻,靜置10 min,再加入5 mmol/L的水楊酸溶液2 mL,混勻,37 ℃水浴30 min后,波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度B1,用蒸餾水代替水楊酸測(cè)定吸光度B2,以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定吸光度B0,以維生素C作為對(duì)照,樣品對(duì)·OH的清除率Y(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100[15-16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所用數(shù)據(jù)是3次平行實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差,響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.06軟件,采用 SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)間的顯著性分析,并利用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)地桃花多糖得率的影響 由圖1可知,當(dāng)酶添加量從2 mg/mL增加到10 mg/mL時(shí),多糖得率顯著提高(p<0.05),由8.19%上升至12.78%,進(jìn)一步加大酶用量,多糖得率沒(méi)有顯著變化(p>0.05),說(shuō)明在該底物濃度下,酶濃度已經(jīng)趨于飽和,繼續(xù)增加纖維素酶用量,對(duì)多糖得率沒(méi)有顯著影響(p>0.05)。因此,選擇10 mg/mL作為纖維素酶的最佳添加量。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Influence of cellulase dosage on the polysaccharide extraction rate注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 pH對(duì)地桃花多糖得率的影響 由圖2可知,當(dāng)pH由3.0增加到5.0時(shí),多糖得率由8.65%增加至最大值12.46%(p<0.05),pH增大到6.0時(shí),多糖得率反而減小,得率為11.98%,與pH4.0、pH5.0比較差異均不顯著(p>0.05)。因?yàn)樵谧钸mpH時(shí),酶分子上活性基團(tuán)的解離狀態(tài)最適于與底物結(jié)合,pH高于或低于最適pH時(shí),活性基團(tuán)的解離狀態(tài)可能發(fā)生改變,酶和底物結(jié)合力減弱,酶反應(yīng)速率降低。因此,酶解最適pH選定為5.0。

圖2 pH對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Influence of pH value on the polysaccharide extraction rate

2.1.3 液料比對(duì)地桃花多糖得率的影響 由圖3可知,當(dāng)液料比由4∶1增加到8∶1時(shí),多糖得率由9.45%增加至13.25%(p<0.05),之后,隨著液料比繼續(xù)增大,多糖得率反而減小,原因可能與過(guò)高液料比不利于多糖物質(zhì)溶出有關(guān),此外,水用量過(guò)大加重后續(xù)濃縮工作負(fù)擔(dān),不利于工業(yè)化實(shí)際生產(chǎn)。故液料比選擇為8∶1 mL/g。

圖3 液料比對(duì)多糖得率的影響 Fig.3 Influence of the ratio of water to material on the polysaccharide extraction rate

2.1.4 酶解溫度對(duì)地桃花多糖得率的影響 由圖4可知,溫度由35 ℃上升到45 ℃,多糖得率由9.35%增大至13.28%,主要因?yàn)闇囟壬咴鰪?qiáng)酶活性,促進(jìn)有效成分溶出,55 ℃時(shí)多糖得率為13.07%,與45 ℃比較變化不顯著(p>0.05),進(jìn)一步提高溫度至65 ℃,此時(shí)多糖得率顯著減小(p<0.05),這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致酶活力減弱所致。因此選擇45 ℃為最適酶解溫度。

圖4 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 Fig.4 Influence of hydrolysis temperature on the polysaccharide extraction rate

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)地桃花多糖得率的影響 由圖5可知,酶解40 min時(shí)多糖得率為8.65%,當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至80 min時(shí),多糖得率接近160 min時(shí)的最大值,再繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,多糖得率變化不顯著(p>0.05),多糖提取效率反而降低,此外,酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),酶催化活性減弱反而對(duì)多糖提取不利,考慮實(shí)際生產(chǎn)效率。因此,本研究選擇80 min為最佳酶解時(shí)間。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 Fig.5 Influence of hydrolysis time on the polysaccharide extraction rate

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2,回歸模型方差分析見(jiàn)表3。對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,獲得自變量(液料比、酶解時(shí)間、酶添加量、酶解溫度)與地桃花多糖得率(Y)的二次多項(xiàng)回歸方程:

表2 地桃花多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface design for Urena lobata L. polysaccharides extraction

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

Y=12.98-0.36A-0.73B+0.82C-0.13D+1.67AB-0.27AC-0.18AD+0.83BC+1.26BD-1.17CD-1.37A2-1.86B2-1.35C2-1.42D2。

由表3的F值可知,地桃花多糖纖維素酶法提取影響因素的主次順序?yàn)?酶添加量(C)>酶解時(shí)間(B)>液料比(A)>酶解溫度(D),其中A影響極顯著(p<0.01),B、C影響顯著(p<0.05),D影響不顯著(p>0.05)。平方項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響極顯著(p<0.01)。因素間交互作用對(duì)地桃花多糖得率的影響如圖6所示。由圖6(a、d、e、f)和表3方差分析結(jié)果可知,AB、BC、BD、CD交互作用對(duì)多糖得率影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01),AC、AD間交互作用對(duì)多糖得率影響不顯著(p>0.05)。

圖6 各因素交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面圖 Fig.6 Response surface graphs of effect of interactions of various factors on polysaccharide yield

2.2.2 最佳提取條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 對(duì)回歸模型方程求解,獲得地桃花多糖纖維素酶提取的最佳條件為液料比7.2∶1 mL/g,酶解溫度 43.2 ℃,酶解時(shí)間71.8 min,酶添加量10.74 mg/mL,此條件下多糖得率為13.37%?？紤]實(shí)際操作方便,將上述最佳提取參數(shù)修改為液料比7∶1 mL/g,酶解溫度 43 ℃,酶解時(shí)間72 min,酶添加量10.8 mg/mL,根據(jù)工藝條件進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn),所得多糖得率為13.32%±1.15%,與回歸方程理論多糖得率13.37%的相對(duì)誤差為0.37%,提示本響應(yīng)面法得到的回歸模型有效、可靠,得到的纖維素酶提取地桃花多糖工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 地桃花多糖的體外抗氧化活性

2.3.1 地桃花多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用 由圖7可知,當(dāng)?shù)靥一ǘ嗵菨舛仍?.2～10 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基清除率不斷增大,當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),地桃花多糖對(duì)DPPH自由基清除率為90.06%,而維生素C對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)94.12%,地桃花多糖清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50為1.082 mg/mL,維生素C的IC50為0.643 mg/mL,兩者比較,地桃花多糖清除能力較弱于維生素C。以上結(jié)果提示地桃花多糖具有較好的DPPH自由基清除作用。

圖7 地桃花多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effect of polysaccharide from Urena lobata L. on DPPH radical

2.3.2 地桃花多糖對(duì)·OH清除作用 由圖8可知,當(dāng)?shù)靥一ǘ嗵菨舛仍?.2～10 mg/mL時(shí),對(duì)·OH清除率穩(wěn)步提升,而維生素C在濃度4 mg/mL時(shí)對(duì)·OH清除率就已達(dá)到最大值,之后趨于穩(wěn)定。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),地桃花多糖對(duì)·OH清除率為89.75%,維生素C對(duì)·OH清除率可達(dá)96.38%,地桃花多糖清除·OH的IC50為3.202 mg/mL,維生素C的IC50為0.368 mg/mL,兩者比較,維生素C清除能力強(qiáng)于地桃花多糖。以上結(jié)果說(shuō)明,地桃花多糖具有較好的·OH清除作用。

圖8 地桃花多糖對(duì)·OH的清除作用Fig.8 The scavenging effect of polysaccharide from Urena lobata L. on hydroxyl radical

3 討論與結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)考察了地桃花多糖纖維素酶提取的工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn),纖維素酶添加量對(duì)地桃花多糖得率影響最大,其次是酶解時(shí)間和液料比,而酶解溫度對(duì)其多糖提取影響最小;地桃花多糖最佳酶解提取條件為酶添加量10.8 mg/mL、酶解時(shí)間72 min、液料比7∶1 mL/g、酶解溫度43 ℃、pH=5.0,在此條件下地桃花多糖的得率為13.32%,與回歸模型方程預(yù)測(cè)值13.37%相比,相對(duì)誤差小于5%。藍(lán)峻峰等[14]探討超聲波法輔助半仿生法提取地桃花中多糖的最佳工藝,采用半仿生提取,在超聲波協(xié)同作用的基礎(chǔ)上,以正交試驗(yàn)法考察超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度等因素對(duì)多糖得率的影響,結(jié)果獲得地桃花多糖得率為12.86%,稍小于本研究中的多糖得率,本研究酶法提取溫度43 ℃明顯低于其提取溫度75 ℃,節(jié)約能源,且不需要大型設(shè)備,液料比明顯減小,可一定程度上提高生產(chǎn)效率。

體外抗氧化活性試驗(yàn)表明,地桃花多糖對(duì)DPPH自由基、·OH均具有較強(qiáng)的清除能力,在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度下,其對(duì)兩種自由基的清除能力均呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系。地桃花多糖清除DPPH自由基的IC50為1.082 mg/mL,清除·OH的IC50為3.202 mg/mL。但與維生素C比較,地桃花多糖清除兩種自由基的能力較弱。薛井中等也研究地桃花水提取物清除·OH和DPPH自由基、及抑制油脂氧化的能力,結(jié)果表明地桃花提取物各部位均有一定的抗氧化能力,但抗氧化活性都弱于維生素C[17],與本研究結(jié)果一致。以上結(jié)果為地桃花功能成分的研究開(kāi)發(fā)提供一定的前期理論基礎(chǔ)。