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(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122; 2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

蠶豆醬是以脫殼后的蠶豆為主要原料,與面粉混合后經(jīng)制曲、發(fā)酵而制成的調(diào)味醬[1]。傳統(tǒng)蠶豆醬主要為家庭作坊式生產(chǎn),面臨生產(chǎn)水平低、發(fā)酵周期長(zhǎng)、加工期存在時(shí)限性、規(guī)模化程度低、質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。因此,需采用科學(xué)的生產(chǎn)工藝,對(duì)蠶豆醬的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)。擠壓膨化技術(shù)作為一種新型食品加工技術(shù),為食品加工提供了新方法,為我國(guó)醬類生產(chǎn)傳統(tǒng)工藝的改進(jìn)提供了一條新途徑[2]。采用擠壓膨化技術(shù)對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理,與傳統(tǒng)的原料預(yù)處理方法相比,可省去蒸煮、殺菌等工序,有利于蛋白質(zhì)適度變性、淀粉完全糊化,進(jìn)而提高蛋白質(zhì)和淀粉的利用率,縮短發(fā)酵周期[3-4],進(jìn)而可提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。采用擠壓膨化技術(shù)預(yù)處理原料制作蠶豆醬,卻尚未研究報(bào)道。

在蠶豆醬制作的過程中,需采用擠壓膨化技術(shù)預(yù)處理原料后進(jìn)行制曲,然后發(fā)酵。制曲是醬制品釀造過程中的關(guān)鍵步驟,評(píng)價(jià)成曲質(zhì)量的重要指標(biāo)之一是蛋白酶活力的高低[5-6]。原料的預(yù)處理效果直接影響曲霉菌的生長(zhǎng)情況,進(jìn)而影響蛋白酶的分泌,從而影響蛋白酶的活力。本試驗(yàn)采用擠壓膨化的預(yù)處理方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)蒸煮方法釀造蠶豆醬,而部分?jǐn)D壓膨化工藝參數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的變性程度有直接影響,具體包括:螺桿轉(zhuǎn)速、機(jī)筒末區(qū)溫度、物料水分含量等。因此,研究擠壓膨化參數(shù)對(duì)成曲酶活力的影響很有必要。

本研究采用擠壓膨化技術(shù)預(yù)處理蠶豆粉和面粉混合物,然后進(jìn)行制曲,以成曲中的蛋白酶活力為指標(biāo),通過單因素試驗(yàn),研究擠壓膨化參數(shù)(螺桿轉(zhuǎn)速、面粉比例、機(jī)筒末區(qū)溫度、物料水分含量)對(duì)成曲蛋白酶活力的影響,并結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)擠壓膨化工藝進(jìn)行優(yōu)化,為擠壓膨化技術(shù)進(jìn)一步用于蠶豆醬生產(chǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶豆粉 市購(gòu);面粉 香滿園優(yōu)質(zhì)特一小麥粉;曲精 上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司;Folin試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 以上均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 純度92%,北京百靈威科技有限公司。

FMHE36-24型雙螺桿擠壓機(jī) 湖南富馬科食品工程技術(shù)有限公司;HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海柏欣儀器設(shè)備廠;Eppendorf-5804R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司;AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RQH-150智能人工氣候培養(yǎng)箱 鄭州生元儀器有限公司;Waters600高效液相色譜儀 美國(guó)沃特斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蠶豆醬的制作

1.2.1.1 擠壓膨化蠶豆粉和小麥粉混合物 稱取蛋豆粉500 g,按照一定的比例混合面粉,充分混合,置入喂料斗,并調(diào)節(jié)物料水分,物料經(jīng)雙螺桿擠壓機(jī)在一定的螺桿轉(zhuǎn)速、一定的機(jī)筒末區(qū)溫度下進(jìn)行擠壓膨化處理。傳統(tǒng)蒸煮法則是采用旋轉(zhuǎn)式蒸鍋加壓(0.2 MPa)蒸料。

1.2.1.2 膨化物制曲 待擠壓膨化產(chǎn)物冷卻到室溫后,接入0.5%曲精,與擠壓膨化物料混勻后放入30～35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.1.3 發(fā)酵方法 發(fā)酵采用低鹽固態(tài)發(fā)酵。將制好的成曲拌鹽水,控制鹽濃度為15%左右,醬醅含水量為50%,用保鮮膜封口。發(fā)酵溫度為35 ℃,發(fā)酵20 d,醬醅成熟,發(fā)酵結(jié)束。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 部分?jǐn)D壓參數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的變性程度有直接影響,包括螺桿轉(zhuǎn)速、機(jī)筒末區(qū)溫度、物料水分含量[7-8]。因此結(jié)合本試驗(yàn)將蠶豆粉與面粉按比例混合，以中性蛋白酶活力為指標(biāo)，選擇與擠壓直接相關(guān)的螺桿轉(zhuǎn)速(60、80、100、120、140 r/min)、面粉添加比例(10%、15%、20%、25%、30%)、機(jī)筒末區(qū)溫度(75、90、105、120、135℃)、物料水分含量(33%、38%、43%、48%、53%)4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素，分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，固定螺桿轉(zhuǎn)速120 r/min，面粉添加比例20%，機(jī)筒末區(qū)溫度120℃，物料水分含量43%。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析,利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì),以中性蛋白酶活力(Y1)為響應(yīng)值,以螺桿轉(zhuǎn)速、面粉添加比例、機(jī)筒末區(qū)溫度、物料水分含量為因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 蛋白酶活力的測(cè)定 蠶豆醬生產(chǎn)工藝主要利用蛋白酶等酶系,其中主要為米曲霉產(chǎn)生的中性蛋白酶。以膨化物為原料得到的成曲中性蛋白酶活力用福林酚法測(cè)定,參照文獻(xiàn)[9]并稍作修改。

蛋白酶活力的定義:40 ℃,pH7.5條件下,1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量,定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.3.2 成曲中多肽分子量分布的測(cè)定 分別稱取蒸煮物料與擠壓膨化物料制曲后的成曲6 g于150 mL三角瓶?jī)?nèi),加入95 mL pH7.2磷酸緩沖溶液,搖勻,在瓶口塞上橡皮塞后,55 ℃水浴2 h,拔下塞子,沸水浴中煮沸15 min。取出迅速冷卻至室溫,轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶,定容至100 mL。10000 r/min離心15 min,吸取上清液,過0.45 μm水性微孔濾膜后進(jìn)樣,進(jìn)行多肽分子量分布的測(cè)定[10],測(cè)定條件:采用TSK gel 2000 SWXL型色譜柱,紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm,流動(dòng)相為乙腈/水/三氟乙酸=40/60/0.05,進(jìn)樣體積為10 μL。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定 參照GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》,測(cè)定蠶豆醬中的氨基酸態(tài)氮含量[11]。

1.3.4 水分含量的測(cè)定 參照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》,測(cè)定蠶豆醬的水分含量[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Origin和SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

選取2016年3月—2018年3月進(jìn)入本院接受治療的72例早期強(qiáng)直性脊柱炎骶髂關(guān)節(jié)病變患者作為此次實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，先后給予X線診斷、多層CT診斷及MRI診斷，其中男性患者42例（58.33%），女性患者30例（41.67%）；患者平均年齡為（57.45±2.62）歲；平均病長(zhǎng)時(shí)間為（1.45±0.62）年；所有患者的性別、年齡和病長(zhǎng)時(shí)間等基本資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)X線診斷、多層CT診斷和MRI診斷實(shí)施后患者診斷的準(zhǔn)確率進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)中性蛋白酶活力的影響 由圖1可知,中性蛋白酶活力隨著螺桿轉(zhuǎn)速的增加呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì),當(dāng)螺桿轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí),中性蛋白酶活力最高,為1300.6 U/g。當(dāng)螺桿轉(zhuǎn)速低于120 r/min時(shí),隨著螺桿轉(zhuǎn)速的增大,物料在擠壓機(jī)內(nèi)的滯留時(shí)間縮短,而剪切力會(huì)隨之增大,且后者的作用大于前者,表現(xiàn)為物料的適度變性[13],有利于曲霉菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用,有利于酶的生成,因此蛋白酶活力提高。當(dāng)螺桿轉(zhuǎn)速超過120 r/min時(shí),物料在擠壓機(jī)內(nèi)的滯留時(shí)間極短,蛋白質(zhì)變性程度降低,淀粉未能充分糊化,影響微生物對(duì)曲料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用。因此,螺桿轉(zhuǎn)速可初步確定為120 r/min左右，故選擇110、120、130 r/min進(jìn)行下一步的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)中性蛋白酶活力的影響Fig.1 Effects of screw speed on neutral protease activity

2.1.2 面粉添加比例對(duì)中性蛋白酶活力的影響 由圖2可知,當(dāng)面粉添加比例為20%時(shí),成曲中性蛋白酶活力最高,為1264.5 U/g。面粉在原料內(nèi)部起到潤(rùn)滑作用,當(dāng)面粉含量過高時(shí),剪切力下降,淀粉未能充分降解[14],從而影響成曲的質(zhì)量,蛋白酶活力受影響;面粉含量過低時(shí),小顆粒狀的蠶豆粉之間摩擦力增大,不易熔融,導(dǎo)致膨化物狀態(tài)不均勻[3],也會(huì)對(duì)成曲質(zhì)量造成影響,使蛋白酶活力降低。因此,面粉添加比例可初步確定為20%左右，故選擇15%、18%、21%進(jìn)行下一步的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 面粉添加比例對(duì)中性蛋白酶活力的影響Fig.2 Effects of wheat flour addition on neutral protease activity

2.1.3 機(jī)筒末區(qū)溫度對(duì)中性蛋白酶活力的影響 由圖3可知,成曲中性蛋白酶活力隨機(jī)筒末區(qū)溫度的升高而增加。當(dāng)超過120 ℃時(shí),中性蛋白酶活力提高程度隨溫度增加顯著,在機(jī)筒末區(qū)溫度為135 ℃時(shí),中性蛋白酶活力最高,為1110.72 U/g。當(dāng)機(jī)筒末區(qū)溫度低于120 ℃時(shí),蛋白質(zhì)不能達(dá)到完全變性[3],原料不能被菌體分泌的酶分解利用,從而造成中性蛋白酶活力降低。而機(jī)筒末區(qū)溫度過高,會(huì)使原料出現(xiàn)不可逆熱變性。因此,機(jī)筒末區(qū)溫度可初步確定為135 ℃左右?？紤]到135 ℃后中性蛋白酶活力有可能會(huì)繼續(xù)升高，因此將140 ℃納入響應(yīng)面試驗(yàn)范圍，故選擇110、125、140 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 機(jī)筒末區(qū)溫度對(duì)中性蛋白酶活力的影響Fig.3 Effects of barrel temperature on neutral protease activity

2.1.4 物料水分含量對(duì)中性蛋白酶活力的影響 由圖4可知,隨著物料水分含量增加,中性蛋白酶活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)物料水分含量為43%時(shí),中性蛋白酶活力最高,為1212.5 U/g。當(dāng)物料水分含量增加時(shí),擠壓膨化后的物料容易結(jié)塊,通透性變差,抑制了曲霉菌的生長(zhǎng),影響蛋白酶的分泌,導(dǎo)致蛋白酶活力降低[15]。另外,水分含量過高,會(huì)造成細(xì)菌等雜菌容易生長(zhǎng),生產(chǎn)安全性下降[16]。因此,物料水分含量可初步確定為43%左右，故選擇38%、43%、48%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 物料水分含量對(duì)中性蛋白酶活力的影響Fig.4 Effects of moisture content of ingredient on neutral protease activity

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與分析 利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì),以螺桿轉(zhuǎn)速、面粉添加比例、機(jī)筒末區(qū)溫度和物料水分含量為響應(yīng)變量,以中性蛋白酶活力為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合,建立擠壓膨化工藝參數(shù)回歸模型?；貧w方程為:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

Y=1342.03+23.25A-65.49B+61.66C+54.64D+67.79AB-72.27AC-3.89AD+10.41BC+85.76BD+3.38CD-44.63A2-132.31B2-130.11C2-227.36D2。

利用SAS9.1.3軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到回歸模型并對(duì)其進(jìn)行回歸方差分析及顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of varlances for the regression equation

2.2.2 響應(yīng)面曲面交互作用分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素A、B、C、D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖,從響應(yīng)面分析圖上可以看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面坡度越陡峭,說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)綖槊舾?該因素對(duì)中性蛋白酶活力的影響越大[17-21]。等高線密集呈橢圓形,說(shuō)明兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響大;等高線呈圓形則說(shuō)明影響不大。各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響和等高線圖如圖5～圖10所示。在交互項(xiàng)對(duì)酶活力的影響中,螺桿轉(zhuǎn)速(A)和機(jī)筒末區(qū)溫度(C),面粉添加比例(B)和物料水分含量(D)之間交互作用顯著。

圖5 螺桿轉(zhuǎn)速與面粉添加比例對(duì)中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of screw speed and wheat flour addition on neutral protease activity

圖6 螺桿轉(zhuǎn)速與機(jī)筒末區(qū)溫度對(duì)中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of screw speed and barrel temperature on neutral protease activity

圖7 螺桿轉(zhuǎn)速與物料水分含量對(duì)中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of screw speed and moisture content of ingredient on neutral protease activity

圖8 面粉添加比例與機(jī)筒末區(qū)溫度對(duì)中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of wheat flour addition and barrel temperature on neutral protease activity

圖9 面粉添加比例與物料水分含量對(duì)中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of wheat flour addition and moisture content of ingredient on neutral protease activity

圖10 機(jī)筒末區(qū)溫度與物料水分含量對(duì)中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of barrel temperature and moisture content of ingredient on neutral protease activity

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)所得結(jié)果,利用軟件分析后,確定中性蛋白酶活力最大時(shí)的擠壓膨化參數(shù)為:螺桿轉(zhuǎn)速118.47 r/min、面粉添加比例17.45%、機(jī)筒末區(qū)溫度129.04 ℃、物料水分含量43.38%,此時(shí),中性蛋白酶活力預(yù)測(cè)值為1358.89 U/g。為驗(yàn)證模型可行性,考慮到實(shí)際情況,將最佳工藝條件修改為螺桿轉(zhuǎn)速120 r/min、面粉添加比例17%、機(jī)筒末區(qū)溫度130 ℃、物料水分含量45%,在此工藝條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn),并與傳統(tǒng)蒸煮法處理蠶豆粉和面粉混合物制曲后的中性蛋白酶活力進(jìn)行對(duì)照。試驗(yàn)得到的中性蛋白酶活力平均值為(1331.91±8.22) U/g,與預(yù)測(cè)值的誤差為2.03%,說(shuō)明響應(yīng)面法預(yù)測(cè)吻合度較高。而采用傳統(tǒng)蒸煮的方法處理蠶豆粉和面粉混合物后制曲,成曲中性蛋白酶活力為997.16 U/g,與對(duì)照相比,試驗(yàn)組中性蛋白酶活力提高了33.57%。

2.3 兩種處理方式的蠶豆醬成曲多肽分子量分布

由圖11和表4可以看出,不同處理方式預(yù)處理原料制曲后的成曲多肽分子量分布變化顯著。表4中,Mp為峰尖分子量,擠壓處理物料制曲后的成曲小分子量肽的數(shù)量顯著增加。這表明擠壓預(yù)處理后物料的結(jié)構(gòu)更適合于曲霉菌的生長(zhǎng),有利于蛋白酶的分泌,從而酶活較高,小分子肽數(shù)量增加。

圖11 擠壓膨化物料與蒸煮物料制曲后的成曲多肽分子量分布Fig.11 Peptide molecular weight distribution of koji in extrusion process and in cooking process

2.4 蠶豆醬釀造性能研究

在最優(yōu)制曲條件下得到的蠶豆醬顏色呈紅褐色,有光澤,醬香較濃,無(wú)不良?xì)馕?咸甜適口,稀稠適度。經(jīng)檢測(cè)蠶豆醬的氨基酸態(tài)氮含量為0.720 g/100 g,水分為50.75%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)得到的最佳擠壓工藝參數(shù)為:螺桿轉(zhuǎn)速為120 r/min,面粉添加比例為17%,機(jī)筒末端溫度為130 ℃,物料水分含量為45%,在此條件下,成曲中性蛋白酶活力為(1331.91±8.22) U/g。在最優(yōu)制曲條件下得到的蠶豆醬氨基酸態(tài)氮含量為0.720 g/100 g,水分為50.75%,醬香較濃,稀稠適度。該結(jié)論可為傳統(tǒng)蠶豆醬工藝的升級(jí)提供有效的技術(shù)參數(shù)。