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(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

藜麥(Chenopodiumquinoawilld),原產(chǎn)于南美洲的玻利維亞、厄瓜多爾和秘魯。在歐洲、非洲與亞洲普遍為實(shí)驗(yàn)性種植。隨著藜麥作為公認(rèn)的“全能食物”在全球的盛行[1-2],1987年藜麥引入我國(guó)西藏,因其需要特殊的培育種植環(huán)境,目前在山西、四川、青海、陜西等地均建立了藜麥實(shí)驗(yàn)種植區(qū)[2]。藜麥富含纖維素,多不飽和脂肪酸種類豐富,各類維生素及多種礦物質(zhì)含量普遍高于普通谷類[3]。在抗氧化、降血壓降血脂、消炎抗菌等方面天然黃酮效果極為明顯,近年來(lái)存在于植物中的天然黃酮類化合物多用于藥品及保健品的開(kāi)發(fā)。藜麥中含量較高生物活性物質(zhì)具有防癌、消炎、降血壓、減脂等生理活性,如:蘆丁、異槲皮素、槲皮素、山奈酚等,特別是藜麥類黃酮中的槲皮素與其苷類化合物的抗腫消炎、抗氧化的效果極為明顯[4]。

目前,對(duì)于藜麥籽粒中營(yíng)養(yǎng)組成、健康功效及其在食品中應(yīng)用現(xiàn)狀的研究和報(bào)道詳細(xì)[5-6],梁彬等[7]采用微波輔助提取藜麥種子總黃酮提取量為6.5 mg/g。孫雪婷等[8]利用乙醇浸提法提取藜麥種子黃酮提取得率2.64 mg/g,董晶等[9]利用超聲波法提取藜麥黃酮提取率為0.31%,陸敏佳等[10]利用乙醇回流法提取藜麥葉片黃酮提取得率為0.619%等。上述研究多集中在籽粒,且籽粒中黃酮含量較低,而關(guān)于藜麥糠中黃酮的研究卻鮮有報(bào)道。藜麥糠作為藜麥的副產(chǎn)品,應(yīng)加以開(kāi)發(fā)和利用。本實(shí)驗(yàn)以藜麥糠為原料,利用超聲波輔助提取其中的黃酮類化合物,在優(yōu)化提取工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究,以期提高對(duì)藜麥的綜合開(kāi)發(fā)與利用價(jià)值,為藜麥副產(chǎn)物的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

藜麥糠 山西省華青藜麥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(AR≥98%)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(AR≥95%) 美國(guó)Sigma公司;其他所用試劑 均為分析純。

HRHS24型電熱恒溫水浴鍋 青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司;JP-040ST 型超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;TG16A-WS型高速離心機(jī) 武漢愛(ài)斯佩科學(xué)儀器有限公司;SP-2000UV型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藜麥糠黃酮的提取 通過(guò)索氏提取法去除樣品中油脂等雜質(zhì)(GB/T5009.62003)。然后精密稱取一定質(zhì)量樣品粉末于干燥燒杯中,加入乙醇溶液浸泡10 min后利用超聲波清洗器輔助提取,結(jié)束后經(jīng)過(guò)4000 r/min離心20 min后收集上清液進(jìn)行真空抽濾,濾液備用。

1.2.2 藜麥糠黃酮得率的測(cè)定 將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)110 ℃恒溫干燥至恒重并冷卻至室溫備用,配濃度0.186 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于20 mL具塞試管中。30%乙醇補(bǔ)至5 mL,搖勻,向各組加入5%亞硝酸鈉0.3 mL,10%硝酸鋁溶液0.3 mL,靜置5 min,加4%氫氧化鈉溶液2.0 mL,待其充分反應(yīng),分別補(bǔ)加30%乙醇溶液至10 mL,搖勻后靜置}于510 nm處測(cè)定吸光度。記錄數(shù)據(jù),并繪制以吸光度為縱坐標(biāo)以濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線[11],所得回歸方程為Y=0.9932X+0.044(R2=0.991),式中Y為吸光度;X為蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)。

測(cè)定樣液時(shí),精密吸取1 mL樣液于具塞試管中,按照1.2.2的方法處理,在510 nm處測(cè)定其吸光度。根據(jù)公式(1)求出樣品中黃酮的得率:

式(1)

式中,Y為樣品中黃酮的得率(%),W為藜麥糠粉末重量(g),C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得的樣液黃酮濃度(mg/mL),V為定容體積(mL),N為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)考察了乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間和超聲溫度等因素對(duì)樣品中黃酮類化合物得率的影響。稱取2.00 g已預(yù)處理的藜麥糠粉末。固定乙醇濃度60%,超聲時(shí)間為20 min,超聲溫度為60 ℃,考察液料比在10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g條件下黃酮類化合物的得率。固定液料比為30∶1 mL/g,超聲時(shí)間為20 min,超聲溫度為60 ℃,考察乙醇濃度在50%、60%、70%、80%、90%條件下黃酮類化合物的得率。固定液料比為30∶1 mL/g,乙醇濃度60%,超聲溫度為60 ℃,考察超聲時(shí)間在10、20、30、40、50 min條件下黃酮類化合物的得率。固定液料比為30∶1 mL/g,乙醇濃度60%,超聲時(shí)間為20 min,考察超聲溫度在30、40、50、60、70 ℃條件下黃酮類化合物的得率。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),按照Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)[12],其因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of the response surface experiment

1.2.5 藜麥糠黃酮類化合物抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 清除DPPH自由基的測(cè)定方法 按照由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取方案提取黃酮類化合物,并將其稀釋處理。得到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的黃酮提取液,以同濃度的VC作為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[12]。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的黃酮提取液于試管中,分別加入0.052 mg/mL DPPH溶液1.0 mL,搖勻后將其在避光條件下放置30 min得到Ax,設(shè)置空白對(duì)照為2.0 mL乙醇、對(duì)照組A0為1.0 mL DPPH與1.0 mL乙醇混合液記為[13]。反應(yīng)充分后于517 nm處測(cè)定并記錄其吸光度值,按照公式(2)計(jì)算DPPH的清除率。

式(2)

1.2.5.2 清除羥自由基(·OH)的測(cè)定方法 配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液備用與8.8 mmol/L H2O2溶液。配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的黃酮提取液,以同濃度的VC作為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取各質(zhì)量濃度的黃酮類化合物提取液1.0 mL于試管中,向各試管中分別依次加入1.0 mL已配制好的FeSO4、1.0 mL的水楊酸-乙醇溶液。再依次在試管中加入1.0 mL已配制的H2O2,將加好藥品的試管置于水浴鍋中設(shè)置溫度為37 ℃,30 min后于510 nm波長(zhǎng)處得到樣品組吸光度Ax。將樣品組的H2O2用蒸餾水代替其他步驟同上得到對(duì)照組吸光度Ay。A0記為用蒸餾水代替樣品得到對(duì)照組吸光度[14],按公式(3)計(jì)算清除率。

式(3)

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)黃酮類化合物得率的影響 由圖1可知,當(dāng)液料比低于20∶1 mL/g時(shí)得率隨著液料比的增大逐漸上升,20∶1 mL/g時(shí)達(dá)到最大0.887%,隨后得率反而逐漸降低。推測(cè)原因可能是在液料比小于20∶1 mL/g時(shí),由于溶劑的增加增大了提取液乙醇與提取物藜麥糠的接觸面積,使溶出的黃酮類化合物量增大;液料比20∶1～30∶1 mL/g之間黃酮得率趨于平緩,雖減小但并不明顯,黃酮類化合物的溶出逐漸趨于動(dòng)態(tài)平衡[14],在液料比大于20∶1 mL/g后得率下降是由于其它雜質(zhì)的溶出對(duì)黃酮化合物產(chǎn)生拮抗作用。可見(jiàn),當(dāng)液料比為20∶1 mL/g時(shí),藜麥糠中黃酮類化合物的得率相對(duì)較高。

圖1 液料比對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effect of liquid/solid ratio on flavonoid yield

2.1.2 乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物得率的影響 由圖2可知,乙醇濃度在50%～60%黃酮得率為先上升趨勢(shì),體積分?jǐn)?shù)為60%達(dá)得率最大0.884%,在乙醇濃度大于60%時(shí),黃酮得率逐漸降低,當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí),其得率為實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最低。根據(jù)相似相溶原理,推測(cè)黃酮類化合物的極性與60%乙醇溶液最為接近,并且在乙醇濃度為60%時(shí),黃酮類物質(zhì)溶出趨于飽和。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí),由于其他醇溶性的雜質(zhì)等的析出[15],由此可知,當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí),藜麥糠中黃酮類化合物的得率較高。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on flavonoid yield

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物得率的影響 由圖3可知,在超聲時(shí)間為10～30 min時(shí),黃酮得率呈先升高而后略微降低的趨勢(shì),在超聲時(shí)間為30 min之后黃酮得率基本保持不變。在超聲時(shí)間為20 min時(shí)得率達(dá)最大值0.74%,在20 min以后得率略微減小且均在0.6%左右。在超聲時(shí)間20 min之內(nèi),由于時(shí)間的延長(zhǎng),物料與乙醇溶液逐漸充分接觸,使物料中黃酮類化合物能充分地溶出。當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至20 min后,有可能使溶出的黃酮類物質(zhì)發(fā)生降解或也伴隨其他雜質(zhì)的溶出[15],故得出最適超聲時(shí)間為20 min。

2.1.4 超聲溫度對(duì)得率的影響 由圖4可知,超聲溫度較低于40 ℃時(shí)提取較為困難得率較低,低于0.5%;隨著提取溫度的升高,得率也逐漸增加,在超聲溫度高達(dá)50 ℃時(shí)得率達(dá)到最大值0.889%,之后繼續(xù)升高溫度得率反而降低,在70 ℃時(shí),得率降至 0.5%左右。經(jīng)分析此變化產(chǎn)生的原因可能是,在溫度在低于50 ℃時(shí)隨著溫度的升高,物料內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)速率逐漸增加,使黃酮類化合物更容易溶出[15]。但在50 ℃以上,高溫使提取液中其他雜質(zhì)成分與黃酮類化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)出現(xiàn)絮狀沉淀,導(dǎo)致有效成分減少[16],且溫度高于60 ℃時(shí)溶劑揮發(fā)量增加導(dǎo)致得率降低,故得出超聲溫度50 ℃為最適溫度。

圖4 超聲溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on flavonoid yield

2.2 響應(yīng)面分析及藜麥糠黃酮類化合物工藝優(yōu)化

利用Design-Expert V8.0.6軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì),以液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度為響應(yīng)變量,黃酮得率為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken test design and results

2.2.1 模型建立和顯著性分析 由表3可知,得到回歸方程為:

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the regression equation

Y=0.80-0.019A-0.045B-0.034C-0.017D-0.019AB+0.00825AC+0.015AD+0.039BC+0.028BC+0.003CD-0.12A2-0.086B2-0.091C2-0.029D2

由表3與回歸方程分析可知,p<0.001,則顯示模型為極顯著,此模型中失擬性不顯著,表示此模型設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)值能與實(shí)際值相近,有良好的線性關(guān)系,根據(jù)此模型不僅可以得到藜麥糠黃酮類化合物提取的最優(yōu)工藝,并且可以真實(shí)的反映藜麥糠中的黃酮類化合物含量。由表3可知,從F值可以看出:對(duì)于本實(shí)驗(yàn)黃酮類化合物的提取影響因素排序?yàn)?B乙醇濃度>C超聲溫度>A液料比>D超聲時(shí)間。實(shí)驗(yàn)因素中,一次項(xiàng):A、D,交互項(xiàng)BD對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著顯著影響,而一次項(xiàng):B、C,交互項(xiàng)BC及各二次項(xiàng)均對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為極顯著的影響,而其余項(xiàng)對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響不顯著[17-18]。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)表2設(shè)計(jì),經(jīng)過(guò)Densign-Eexpert 8.0分析得知,固定一個(gè)因素為0水平,分析另外兩個(gè)因素的交互作用對(duì)藜麥糠黃酮類化合物得率的影響,兩因素交互作用的影響如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對(duì)黃酮類化合物得率的影響Fig.5 Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of flavonoid

在其他實(shí)驗(yàn)因素固定不變的情況下,考察交互項(xiàng)對(duì)得率的影響,響應(yīng)面分析圖可用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)黃酮得率影響的交互作用。在兩因素交互作用3D圖中,圖形的坡度越陡,表明響應(yīng)指標(biāo)對(duì)響應(yīng)因素的變化越敏感[19-20]。在交互相對(duì)得率的影響中,乙醇濃度與超聲溫度和乙醇濃度與超聲時(shí)間之間交互作用明顯,而其他因素兩兩交互作用對(duì)得率影響并不明顯,這與方差分析結(jié)果一致。

由Design-Expert分析,藜麥糠黃酮類化合物提取的最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度為56%,液料比為20∶1 mL/g,超聲時(shí)間為14 min,超聲溫度為58 ℃,預(yù)測(cè)得率為0.821%。按照上述工藝條件,進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)際得率為0.802%±0.012%。故此條件具有可靠性和可操作性。

2.3 抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 藜麥糠黃酮類化合物提取物的DPPH清除能力 由圖6可知,VC溶液的DPPH清除能力隨著其濃度變化在濃度0.1～0.2 mg/mL之間清除率變化最小,在0.2～0.3 mg/mL時(shí)清除率變化最大。黃酮提取液于0.1～0.3 mg/mL時(shí),其清除率呈線性增加。提取液濃度范圍在0.3～0.4 mg/mL時(shí),其清除率增加顯著,而在0.4 mg/mL后,其DPPH清除率增加較為緩慢[21]。但黃酮類化合物提取液的清除能力始終弱于VC,在質(zhì)量濃度較低小于0.2 mg/mL時(shí),兩者DPPH清除能力均較弱且相差不大,在本實(shí)驗(yàn)中VC質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)89%,同濃度黃酮類化合物提取液的DPPH清除率達(dá)64%左右,表明藜麥糠黃酮類化合物提取液有良好的自由基清除能力。

圖6 藜麥糠黃酮類化合物提取物的DPPH清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging capacity of flavonoid from Chenopodium quinoa bran

2.3.2 藜麥糠黃酮類化合物提取物的羥自由基(·OH)清除能力 由圖7可知,黃酮提取液的羥自由基清除能力與其質(zhì)量濃度成正比[22],在二者質(zhì)量濃度小于0.3 mg/mL時(shí)黃酮類化合物提取液清除率遠(yuǎn)低于VC。當(dāng)二者質(zhì)量濃度高于0.3 mg/mL后,二者清除率能力相差不大,在0.3 mg/mL時(shí)二者清除率最為接近。黃酮類化合物提取物質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)的羥自由基清除率達(dá)77%,在此濃度下其清除羥自由基能力與VC相差不大。但總體來(lái)說(shuō),樣液羥自由基清除能力的趨勢(shì)與VC大致相似。

圖7 藜麥糠黃酮類化合物提取物的羥自由基(·OH)清除能力Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging capacity of flavonoid from Chenopodium quinoa bran

3 結(jié)論

以藜麥糠為原料,借助超聲波輔助提取藜麥糠黃酮類化合物,通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝,并對(duì)其提取物進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)得出最佳的提取條件為:乙醇濃度56%,液料比20∶1 mL/g,超聲時(shí)間14 min,超聲溫度58 ℃,在此條件下黃酮的得率為0.802%±0.012%。按響應(yīng)面設(shè)計(jì)最佳提取條件,進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際得率為0.802%,與預(yù)測(cè)值大致相符。此外,進(jìn)行了藜麥糠黃酮類化合物的抗氧化性實(shí)驗(yàn)測(cè)定。表明,藜麥糠黃酮作為一種天然的抗氧化劑,具有與VC相當(dāng)?shù)那宄u自由基清除能力和較強(qiáng)的DPPH清除能力。此實(shí)驗(yàn)為藜麥糠中生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)提供了重要依據(jù)。