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(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040; 2.黑龍江童醫(yī)兒童生物制藥有限公司,黑龍江哈爾濱 150040)

紅樹莓(RubusideausL.)屬薔薇科懸鉤子屬,俗名覆盆子、托盤等。紅樹莓中含有大量的活性物質(zhì),如多酚、黃酮、原花青素等[1-2]。其活性成分可用于抗癌、抗腫瘤等重癥治療[3-4]。紅樹莓籽作為紅樹莓的副產(chǎn)物,其營養(yǎng)物質(zhì)豐富[5-7],含有人體必需的不飽和脂肪酸[8]和豐富的抗氧化活性物質(zhì),具有積極的生理功效[9]。

趙金璐等[10]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究得出樹莓提取物能抑制肝癌細(xì)胞PCNA的表達(dá),起到抑制其增殖的作用。李萌萌[11]等發(fā)現(xiàn)紅樹莓籽黃酮具有較高的抗氧化活性,能夠清除人體中超氧離子自由基,具有抗癌細(xì)胞增殖作用,同時(shí)還具有強(qiáng)化免疫系統(tǒng)功能、降血壓等功效[12-13]。目前對(duì)紅樹莓籽原花青素的功能研究較少,僅在分離和純化上有所研究。張佰清等[14-15]通過大孔吸附樹脂分離出較高純度的原花青素并測(cè)定了從中分離出的三條色譜帶的平均聚合度。在加工過程中,大量的樹莓籽作為副產(chǎn)品或生產(chǎn)廢物,因缺乏有效的提取工藝而沒有得到開發(fā)和利用。

本實(shí)驗(yàn)為闡明紅樹莓籽中多酚、黃酮、原花青素提取的影響因素,從乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、pH等方面進(jìn)行研究,并通過優(yōu)化獲得最佳提取條件,以期為紅樹莓果籽的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓(秋福) 尚志市采摘后-10 ℃冷凍保存;福林酚 北京新天創(chuàng)高科技有限公司;香草醛 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;兒茶素、沒食子酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃硫酸、濃鹽酸、無水乙醇 均為市售分析純。

DL-6M高速離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;722可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;RT502分析天平 常熟市意歐儀器儀表有限公司;JYL-C23 九陽料理機(jī) 九陽股份有限公司;P70F23P-G5(S0) 微波爐 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司;ND7-2L 球磨機(jī) 南京南大天尊電子有限公司;SHZ-C水浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DK-8D電熱恒溫水槽 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;PHS-3E型PH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅樹莓籽活性物質(zhì)的提取工藝

1.2.1.1 紅樹莓籽脫脂粉的制備 取1 kg于-10 ℃中保存的紅樹莓凍果于微波爐中(解凍擋位)解凍6 min,解凍后的紅樹莓果用榨汁機(jī)粉碎成勻漿狀。榨汁后的樹莓果漿用雙層紗布過濾取籽,之后將紅樹莓籽放于80 ℃烘箱中烘干2 h。烘干后的樹莓籽通過球磨機(jī)進(jìn)行磨粉,過120目篩。使用正己烷作為溶劑在40 ℃條件下超聲脫脂20 min后抽濾得到紅樹莓籽脫脂粉。

1.2.1.2 紅樹莓籽脫脂粉活性物質(zhì)的提取 使用乙醇作為提取溶劑,在控制一定的乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比、pH 5個(gè)條件下對(duì)紅樹莓籽中活性成分進(jìn)行提取,提取液在4000 r/min,20 ℃的條件下離心10 min,之后在45 ℃,0.1 MPa的條件下真空濃縮30 min除去溶劑。用蒸餾水定容至100 mL置于-10 ℃環(huán)境中冷藏備用。

1.2.2 乙醇提取法的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照1.2.1.2的方法,以多酚,黃酮,原花青素含量為指標(biāo),在pH為4,50 ℃的條件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探討不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取含量的影響;使用60%乙醇進(jìn)行提取,在pH為4的條件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取,探討不同提取時(shí)間(1、2、3、4、5 h)對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取含量的影響;使用60%乙醇進(jìn)行提取,在pH為4的條件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探討不同提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取含量的影響;使用60%乙醇進(jìn)行提取,在pH為4,50 ℃的條件下提取3 h,探討不同料液比(1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55)對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取含量的影響;使用60%乙醇進(jìn)行提取,在50 ℃的條件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探討不同pH(2、3、4、5、6)對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取含量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì),以多酚提取含量為指標(biāo),進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化紅樹莓籽活性物質(zhì)提取工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,自變量的實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼,共設(shè)計(jì)29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 紅樹莓籽活性物質(zhì)提取含量的測(cè)定

1.2.4.1 紅樹莓籽中多酚提取含量的測(cè)定 采用福林酚法[16]測(cè)定紅樹莓籽多酚提取含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,沒食子酸濃度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)為橫坐標(biāo),765 nm處吸光度為縱坐標(biāo)。其線性回歸方程為y=8.8503x+0.0111(R2=0.9991)。紅樹莓籽多酚提取含量以每克脫脂干紅樹莓籽粉中總酚的毫克數(shù)表示。

1.2.4.2 紅樹莓籽中黃酮提取含量的測(cè)定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[17]測(cè)定紅樹莓籽總黃酮提取含量。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,蘆丁濃度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)為橫坐標(biāo),510 nm處吸光值為縱坐標(biāo)。其線性回歸方程為y=1.0229x+0.0003(R2=0.9992)。紅樹莓籽黃酮提取含量以每克脫脂干紅樹莓籽粉中黃酮的克毫數(shù)表示。

1.2.4.3 紅樹莓籽中原花青素提取含量的測(cè)定 采用香草醛-硫酸法[18]測(cè)定紅樹莓籽原花青素提取含量。以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品,兒茶素濃度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)為橫坐標(biāo),500 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)。其線性回歸方程為y=1.6957x-0.0010(R2=0.9994)。紅樹莓籽原花青素提取含量以每克脫脂干紅樹莓籽粉中原花青素的毫克數(shù)表示。

1.2.4.4 紅樹莓籽中多酚,黃酮,原花青素計(jì)算公式 總酚/總黃酮/原花青素提取量(mg/g)=(C×V×n)/m;式中:C代表根據(jù)回歸方程計(jì)算得到的質(zhì)量濃度(mg/mL),V代表提取液總體積(mL),n代表稀釋倍數(shù),m代表脫脂干紅樹莓籽粉末的質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel、Origin Pro 8.1、Design-Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)紅樹莓籽中活性物質(zhì)提取量的影響 如圖1所示,當(dāng)乙醇濃度在40%～60%時(shí),多酚的提取含量隨乙醇濃度增加而增加,當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí),多酚的提取含量達(dá)到最大值為(31.91±0.52) mg/g。此時(shí)黃酮和原花青素的提取含量也達(dá)到最大,黃酮的提取含量為(15.22±0.43) mg/g,原花青素為(18.98±0.39) mg/g;當(dāng)乙醇濃度高于60%,多酚的提取含量開始下降。乙醇濃度對(duì)黃酮的提取含量影響與李萌萌等[6]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,對(duì)原花青素的影響與吳迪[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。這可能是乙醇濃度增大了其他物質(zhì)的溶出從而抑制了還原性物質(zhì)的提取[19]。當(dāng)乙醇濃度較高時(shí),色素、醇溶性雜質(zhì)等物質(zhì)溶解,這些物質(zhì)影響了活性物質(zhì)與醇結(jié)合的能力,同時(shí),高濃度的乙醇會(huì)降低細(xì)胞的通透性,從而抑制活性物質(zhì)的析出,使其提取含量降低[20]。綜合上述情況,最佳乙醇濃度范圍選擇40%～60%。

圖1 乙醇濃度對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽中活性物質(zhì)提取量的影響 如圖2所示,三種活性物質(zhì)的提取含量隨提取時(shí)間的增長均為先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為4 h時(shí),多酚和原花青素的提取含量都達(dá)到最大值分別為35.13、20.92 mg/g;黃酮的提取含量在3 h時(shí)達(dá)到最大為15.30 mg/g;綜合上述情況,最佳提取時(shí)間范圍選擇3～5 h。三種活性物質(zhì)的提取含量隨提取時(shí)間變化的原因是隨著提取時(shí)間的延長,活性物質(zhì)的溶出率隨之增加,但當(dāng)提取時(shí)間過長時(shí),多酚類物質(zhì)隨之溶解,導(dǎo)致活性物質(zhì)提取含量降低。

圖2 提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取量的影響Fig.2 Effects of extraction time on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.3 提取溫度對(duì)紅樹莓籽中活性物質(zhì)提取量的影響 如圖3所示,隨著提取溫度的升高,多酚的提取含量先增加后減少;當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí),多酚與黃酮的提取含量達(dá)到最大值分別為30.83、15.34 mg/g。原花青素在實(shí)驗(yàn)提取溫度范圍內(nèi)隨提取溫度升高提取含量降低,30 ℃時(shí)提取含量最大為19.45 mg/g。綜合上述情況,選擇最佳提取溫度范圍為40～60 ℃。多酚與黃酮提取含量變化原因是當(dāng)提取溫度升高時(shí),分子加速運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致樹莓籽中多酚、黃酮等物質(zhì)結(jié)合的氫鍵容易斷裂,從而使他們的析出率增加,擴(kuò)散速度加快,最終使其提取含量增加。同時(shí),將提取溫度繼續(xù)升高,當(dāng)超過50 ℃時(shí),多酚與黃酮等物質(zhì)結(jié)合的氫鍵斷裂后存在不穩(wěn)定,過高的提取溫度也可能會(huì)導(dǎo)致析出的多酚和黃酮被氧化或降解等一系列不可逆反應(yīng),使析出的活性物質(zhì)有所損失,從而導(dǎo)致提取含量降低[21]。

圖3 提取溫度對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取量的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.4 料液比對(duì)紅樹莓籽中活性物質(zhì)提取量影響 如圖4所示,隨著料液比的升高,多酚的提取含量先增加后減少,當(dāng)料液比到達(dá)1∶45 (g/mL)時(shí),多酚的提取含量達(dá)到最大值為35.65 mg/g。當(dāng)料液比為1∶15～1∶35 (g/mL)時(shí),黃酮與原花青素的提取含量隨之升高之后趨于平穩(wěn)。因此,選擇最佳料液比范圍為1∶35～1∶55 (g/mL)。料液比對(duì)活性物質(zhì)提取含量的影響與李萌萌等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,黃酮提取含量均在料液比為1∶35 (g/mL)時(shí)達(dá)到最大?？赡苁请S著料液比的增大,通過提高溶劑用量,可以增加質(zhì)量濃度梯度,活性物質(zhì)從紅樹莓籽組織內(nèi)向外擴(kuò)散過程中,固液間質(zhì)量濃度梯度是提取物發(fā)生轉(zhuǎn)移的動(dòng)力,濃度梯度和擴(kuò)散速率升高,有利于活性物質(zhì)的溶出,導(dǎo)致活性物質(zhì)提取含量的提高;但當(dāng)料液比達(dá)到某一極限后,再提高料液比收效不大或抑制活性物質(zhì)的滲出。

圖4 料液比對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取量的影響Fig.4 Effects of ratio of solid to solvent on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.5 pH對(duì)紅樹莓籽中活性物質(zhì)提取量的影響 如圖5所示,pH對(duì)多酚和原花青素的提取含量影響不大,多酚的提取含量在pH為2和6時(shí)相對(duì)較高，在pH=6時(shí)最大為35.18 mg/g。黃酮和原花青素的提取含量隨pH的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),提取含量在pH=3達(dá)到最大為17.19、21.28 mg/g。pH對(duì)多酚的提取含量影響與曠慧等[22]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。可能原因是強(qiáng)酸性條件破壞了化學(xué)鍵,使結(jié)合力強(qiáng)的多酚被提取出來;或破壞了低聚/多聚酚類物質(zhì)間的結(jié)合力,使單體多酚游離出來;或者可能是在pH=4.5～5.0多酚氧化酶活性較高,分解了多酚類物質(zhì)從而導(dǎo)致多酚的提取含量稍有下降[23]。

圖5 pH對(duì)紅樹莓籽活性物質(zhì)提取量的影響Fig.5 Effects of pH on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果如表2所示。

利用Design-Expert 8.0對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得多酚提取含量(Y)對(duì)自變量料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、乙醇濃度(D)的二元多項(xiàng)回歸模擬方程:

Y=38.03+1.21A+0.70B-0.32C-0.14D-1.17AB-0.63AC-0.60AD-0.34BC-0.36BD-0.071CD-2.85A2-0.63B2-0.80C2-1.53D2

Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果、方差分析分別見表2、表3。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression model

圖6 因素交互作用對(duì)多酚提取含量響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of different factors on the extraction rate of polyphenols

利用Design-Expert 8.0分析得到最佳條件工藝為:料液比1∶50.37 (g/mL)、提取溫度50.61 ℃、提取時(shí)間3.48 h、乙醇濃度57.22%?？紤]實(shí)際情況,將以上條件校正為:料液比1∶50 (g/mL)、提取溫度51 ℃、提取時(shí)間3.5 h、乙醇濃度57%。根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最終得到多酚提取含量Y=(38.32±0.25) mg/g,與預(yù)測(cè)值38.4761 mg/g相差0.41%,因此可確定其為最佳工藝條件,此時(shí),測(cè)得黃酮與原花青素的提取含量分別為(17.50±0.14)和(19.71±0.27) mg/g。

3 結(jié)論

紅樹莓籽中活性物質(zhì)的最佳提取工藝為:料液比1∶50 (g/mL)、提取溫度51 ℃、提取時(shí)間3.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)57%、pH=3。在此工藝條件多酚的提取含量為(38.32±0.25) mg/g,黃酮提取含量為(17.50±0.14) mg/g,原花青素提取含量為(19.71±0.27) mg/g。本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面法得到了紅樹莓籽中活性物質(zhì)的最佳提取工藝,為紅樹莓果籽的綜合利用提供理論依據(jù)。