,,

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 3.國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海),上海 201306)

幾丁質(zhì)是N-乙酰葡糖胺通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的不溶性多糖。是自然界中最豐富的多糖之一,主要構(gòu)成真菌細(xì)胞壁[1],以及一些節(jié)肢動(dòng)物的角質(zhì)層和外皮[2]。幾丁質(zhì)酶廣泛存在于各種生命體中,從微生物、動(dòng)植物到人類(lèi)均能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶,參與多種生物過(guò)程,包括幾丁質(zhì)食物消化,形態(tài)發(fā)生,發(fā)病機(jī)理和防御帶有幾丁質(zhì)的病原體等。幾丁質(zhì)酶酶系包括幾丁質(zhì)內(nèi)切酶、外切酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶,只有這三種酶協(xié)同發(fā)揮作用,才能將天然存在的幾丁質(zhì)酶徹底分解為單糖[3-4]。

目前幾丁質(zhì)酶在食品、醫(yī)療及環(huán)保等諸多行業(yè)開(kāi)始逐漸發(fā)展起來(lái),具有廣泛的應(yīng)用,如在生物防治方面,幾丁質(zhì)酶可作為保護(hù)植物的化學(xué)農(nóng)藥替代品,由于幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分,可借助基因工程將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胫参锛?xì)胞,培育出可以抑制病原真菌侵襲的轉(zhuǎn)基因植物。在藥物治療上,幾丁質(zhì)酶可用于增強(qiáng)抗真菌藥物的活性,因此可添加在抗真菌乳膏和乳液中。另外有研究表明哺乳動(dòng)物酸性幾丁質(zhì)酶(AMCase)是控制哮喘疾病中的一個(gè)重要媒介[5]。在降解產(chǎn)物方面,甲殼動(dòng)物約75%的總重量為下腳料,其中幾丁質(zhì)占下腳料干重的20%～58%[6],所以生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶是利用好甲殼動(dòng)物幾丁質(zhì)下腳料的關(guān)鍵。目前關(guān)于甲殼動(dòng)物幾丁質(zhì)酶的研究主要包括蝦、蟹、鰓足蟲(chóng)、溞等[7]。這些研究主要集中在微生物產(chǎn)酶、酶基因表達(dá)及克隆以及幾丁質(zhì)酶在蛻殼中的生理作用等。有關(guān)體內(nèi)天然幾丁質(zhì)酶分離純化的研究不多,所采用的純化手段也不盡相同,但主要以凝膠層析、離子層析、親和層析居多。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii),也稱(chēng)小龍蝦、紅螯蝦等,隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱,是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高、具有一定保健作用的水產(chǎn)品[8]。克氏原螯蝦從幼蝦到性成熟要經(jīng)過(guò)11次蛻殼[9]。隨著幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)研究的日益發(fā)展,幾丁質(zhì)酶的來(lái)源已經(jīng)擴(kuò)展到幾乎整個(gè)生物界,從富含幾丁質(zhì)的甲殼動(dòng)物體內(nèi)提取幾丁質(zhì)酶不失為一種產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的理想來(lái)源,本文以克氏原螯蝦蝦殼為材料,分離純化幾丁質(zhì)酶,以期為后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的研究提供基礎(chǔ)，為不同生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶系的性質(zhì)和功能的比較研究提供借鑒,對(duì)于豐富幾丁質(zhì)酶多樣性,提供充分的科研支持具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮克氏原螯蝦 上海古棕路菜市場(chǎng);幾丁質(zhì) 安徽酷爾生物工程有限公司;N-乙酰氨基葡萄糖苷 南京奧多福尼生物科技有限公司;Sephadex G-100葡聚糖凝膠填料、苯基疏水低取代填料、DEAE-32纖維素填料填料 購(gòu)于GE公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)標(biāo)準(zhǔn)蛋白 購(gòu)于生工;3,5-二硝基水楊酸、鹽酸、氯化鈉、硫酸銨、氫氧化鈉等 購(gòu)于國(guó)藥公司,分析純。

SS250-E組織搗碎機(jī) 方勝電器實(shí)業(yè)有限公司;KYC-100C恒溫振蕩水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器公司;Sorvall Lynx 4000高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技;YC-2型層析實(shí)驗(yàn)冷柜 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;CHRIST ALPHA1-2冷凍干燥機(jī) 北京博勱行儀器有限公司;DYY-III型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCZ-24D型垂直板電泳槽 北京市六一儀器廠;UNICO UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司;TS-2000A型脫色搖床 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;凝膠成像儀 Bio-Rad公司;MALDI Biotyper飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 北京布魯克(BRUKER)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的制備 參照李奕雅[10]的方法作部分改動(dòng)。10 g幾丁質(zhì)緩慢加入到60 mL預(yù)冷的濃HCl中,4 ℃劇烈攪拌12 h,倒入1 L 4 ℃的95%乙醇中,磁力攪拌并室溫放置12 h,4 ℃、5000 r/min離心20 min,收集沉淀,蒸餾水洗至中性后用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液配成1%膠體幾丁質(zhì)。

1.2.2 粗酶液的制備 參照Koga等[11]、林建城[12]的方法作部分改動(dòng)。將克氏原螯蝦解剖,操作過(guò)程中盡可能不破壞蝦殼內(nèi)附著的一層殼膜,以W∶V=2∶1加入預(yù)冷的50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液，于高速組織搗碎機(jī)中勻漿1～2 min,放置4 ℃冰箱抽提過(guò)夜,10000 r/min下離心10 min,取上清液即得到粗酶液,分裝后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.3 酶的分離純化

1.2.3.1 硫酸銨分級(jí)沉淀 取粗酶液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀。收集沉淀蛋白,用少量的50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液溶解,以相同緩沖液為外液進(jìn)行充分透析,用等量1% BaCl2與透析外液混合,直至無(wú)白色沉淀為止為透析充分。

1.2.3.2 Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析 經(jīng)透析除鹽后的酶液上樣于已用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5,含有0.2 mol/L NaCl)緩沖液平衡好的凝膠層析柱,柱規(guī)格為1.6 cm×50 cm,流速為8 mL/h,自動(dòng)收集,每管3.5 mL。檢測(cè)每管蛋白質(zhì)含量和酶活力,收集酶活較高的洗脫峰。

1.2.3.3 苯基疏水層析 將1.2.3.2所得活力組分冷凍濃縮后加入硫酸銨調(diào)節(jié)其終濃度為1 mol/L,過(guò)0.45 μm濾膜后上樣于已用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5,含1 mol/L硫酸銨)緩沖液平衡好的疏水層析柱,柱規(guī)格為 2.6 cm×7 cm,待上述緩沖液流洗去除不結(jié)合的雜蛋白之后，分別用含1～0 mol/L(間隔0.5 mol/L)硫酸銨的緩沖液階段梯度洗脫,流速為1 mL/min,自動(dòng)收集,每管3 mL,檢測(cè)每管蛋白質(zhì)含量和酶活力,收集酶比活較高的洗脫峰。

1.2.3.4 DEAE-32陰離子層析 經(jīng)苯基疏水層析收集的酶液裝入透析袋,用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液為外液進(jìn)行充分透析,濃縮后過(guò)0.22 μm濾膜后，上樣于已用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液平衡好的離子層析柱,柱規(guī)格為2.6 cm×10 cm,分別用含0～0.6 mol/L(間隔0.2 mol/L)NaCl的緩沖液作階段梯度洗脫,流速為1 mL/min,自動(dòng)收集,每管3 mL。測(cè)定每管蛋白質(zhì)含量和酶活力,收集酶比活較高的洗脫峰。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1.2.4.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 采用Folin-酚試劑法[13]測(cè)定蛋白濃度。精確稱(chēng)取0.0300 g牛血清白蛋白溶解于離子水中,定容至100 mL,配成0.3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取該溶液稀釋成不同濃度:0.06,0.12,0.18,0.24,0.3 mg/mL。取不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,分別加入5 mL Folin-酚A試劑,混勻后室溫放置10 min,再加入0.5 mL Folin-酚B試劑,立即搖勻,室溫放置30 min后于650 nm處測(cè)定吸光度值。以O(shè)D650為縱坐標(biāo),蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 樣品蛋白含量的測(cè)定 取1 mL稀釋一定倍數(shù)的酶液,按1.2.4.1中步驟加入Folin-酚各試劑,測(cè)定其OD650。根據(jù)1.2.4.1得蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.00231x,x代表蛋白質(zhì)含量,y代表OD650,R2=0.9972,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算可得出對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定

1.2.5.1 幾丁質(zhì)酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 采用DNS法測(cè)定酶活力。精確稱(chēng)取0.1000 g N-NAG溶解于去離子水中,定容至100 mL,配成1 mg/mL的N-NAG標(biāo)準(zhǔn)品。取該溶液稀釋成不同濃度:0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL。取不同濃度的N-NAG標(biāo)準(zhǔn)品1 mL,分別加入2 mL DNS試劑,煮沸5 min,冷卻至室溫后,于500 nm處測(cè)定吸光度值。以O(shè)D500為縱坐標(biāo),N-NAG濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 酶活體系的測(cè)定 以沸水浴煮沸5 min的熱變性酶為對(duì)照組,取1.5 mL膠體幾丁質(zhì)與1 mL酶液混勻,40 ℃反應(yīng)30 min后立即加入1 mL的2.0 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。取上述混合液1 mL,加入2 mL DNS試劑,沸水浴顯色5 min,冷卻后于10000 r/min離心10 min,取上清液定容至4 mL,測(cè)定500 nm處吸光度值。1個(gè)酶活力單位定義為:上述條件下,每毫升溶液中每分鐘水解膠體幾丁質(zhì)釋放lμg的N-乙酰氨基葡萄糖(N-NAG)所需的酶量。根據(jù)1.2.5.1得N-NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.83x,x代表N-NAG含量,y代表OD500,R2=0.9906,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算樣品酶液N-NAG的生成量而得出幾丁質(zhì)酶活性。

1.2.6 酶相對(duì)分子質(zhì)量和純度鑒定 分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)合SDS-PAGE和飛行質(zhì)譜。SDS-PAGE:分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%,用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(14.4～97.4 KDa)作為參照,將幾丁質(zhì)酶樣品與上樣緩沖液按比例混合,沸水浴煮沸5 min,冷卻后上樣。濃縮膠電流為15 mA,分離膠電流為30 mA。用1%考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠染色,根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白在SDS-PAGE中的相對(duì)遷移率Rf,作Rf-lgMr圖,求得樣品相對(duì)分子質(zhì)量;飛行質(zhì)譜:取1 μL稀釋后的酶樣品與1 μL飽和CHCA基質(zhì)溶液混勻,點(diǎn)在飛行質(zhì)譜儀的ground steel靶板上,自然干燥后送入質(zhì)譜儀中檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次測(cè)定求平均值。統(tǒng)計(jì)分析采用通用統(tǒng)計(jì)軟件Excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化結(jié)果

2.1.1 硫酸銨分級(jí)沉淀 克氏原螯蝦殼膜經(jīng)Tris-HCl緩沖液抽提出粗酶液之后進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀,從圖1可以看出隨著硫酸銨飽和度的增大,上清液中的蛋白含量和酶活力都呈下降趨勢(shì),硫酸銨飽和度在0～30%之間酶活降低較慢,但蛋白質(zhì)含量下降幅度較大,說(shuō)明目標(biāo)酶基本上還留在上清液中,沉淀中主要為其他雜蛋白;當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到70%時(shí)，上清液中的酶活力基本不再減少,趨于平緩,說(shuō)明大部分酶已經(jīng)被沉淀,綜合酶活與酶回收率兩方面考慮,確定收集30%～70%的沉淀。收集沉淀之后用少量緩沖液復(fù)溶,透析之后獲得了純化倍數(shù)為1.50倍的粗酶制劑。

圖1 硫酸銨分級(jí)沉淀Fig.1 Ammonium sulfate fractionation

2.1.2 Sephadex G-100凝膠層析 經(jīng)硫酸銨沉淀之后的酶液上樣于Sephadex G-100凝膠層析,根據(jù)分子量大小的差異,洗脫出3個(gè)蛋白質(zhì)峰和3個(gè)酶活力峰(圖2),其中酶活力峰p1和p3的比活力都較高,但p3蛋白含量較低,p1與p2未完全分開(kāi),考慮到三個(gè)峰的重疊情況和保證酶的回收率,收集14～25管進(jìn)行后續(xù)純化,酶經(jīng)此步驟獲得了比活力7.65 U·mg-1,純化倍數(shù)為2.77倍的酶制劑。

圖2 Sephadex G-100凝膠層析洗脫圖譜Fig.2 Sephadex G-100 chromatography

2.1.3 苯基疏水層析 上一步收集的酶活力峰冷凍濃縮后，上樣于苯基疏水層析柱進(jìn)一步純化,根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異,在洗脫過(guò)程中共出現(xiàn)了3個(gè)蛋白峰(圖3),其中p1為一開(kāi)始用含1 mol/L硫酸銨的緩沖液洗脫出的部分未吸附上柱的雜蛋白,通過(guò)逐步降低硫酸銨濃度洗脫出2個(gè)蛋白質(zhì)峰(p2、p3),均檢測(cè)出了酶活,p2的酶比活力最高,因此收集p2進(jìn)行后續(xù)純化,此時(shí)洗脫液中硫酸銨濃度約為0.5 mol/L左右。此步的純化倍數(shù)為10.54,比上一步提純近4倍。

圖3 苯基疏水層析洗脫圖譜Fig.3 Phenyl Sefinose 6 Fast Flow chromatography

2.1.4 DEAE-32陰離子層析 苯基疏水層析所得酶液經(jīng)透析除鹽,濃縮后上樣于DEAE-32陰離子層析柱。根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同,共洗脫出3個(gè)蛋白峰(圖4)。當(dāng)離子強(qiáng)度約為0.2 mol/L時(shí)活性部分被洗脫下來(lái)。此步提純1.5倍多,回收率為22%。

圖4 DEAE-32陰離子層析洗脫圖譜Fig.4 DEAE-32 Sepharose Fast Flow chromatography

從表1可以看出,本研究對(duì)從克氏原螯蝦殼膜中粗提出的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行了4步純化:硫酸銨分級(jí)沉淀、G-100凝膠層析、苯基疏水層析、DEAE陰離子層析,最終幾丁質(zhì)酶的比活達(dá)44.93 U/mg,純化倍數(shù)約16.28倍,酶回收率為2.98%。其中G-100凝膠層析的純化倍數(shù)較低,可能是為了保證酶回收率而選擇的酶活力峰區(qū)間較寬造成的。苯基疏水層析的純化效果較高,說(shuō)明幾丁質(zhì)酶與其他雜蛋白的疏水差異較大。Michiko KONO等[14]對(duì)日本對(duì)蝦肝臟幾丁質(zhì)酶進(jìn)行了鹽析和2次Sephadex G-100凝膠層析、2次DEAE離子交換層析、1次CM離子交換層析、1次羥磷灰石離子層析,雖然得到了純化了61.3倍、回收率為20.9%的高純度幾丁質(zhì)酶,但操作步驟過(guò)于繁瑣，不適于放大生產(chǎn)。程明哲等[15]對(duì)中國(guó)對(duì)蝦蝦頭采用了無(wú)機(jī)沉淀和一次精制幾丁質(zhì)親和層析，得到了純化倍數(shù)達(dá)108倍的幾丁質(zhì)酶制劑。親和層析是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,根據(jù)載體與被分離物質(zhì)之間高度的親和力而進(jìn)行分離,通常只需經(jīng)過(guò)一步即可使樣品從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái),但載體交昂貴,配基制備困難,有的配基本身要經(jīng)過(guò)分離純化,且實(shí)驗(yàn)條件不同也會(huì)造成純化結(jié)果不同。李奕雅[10]通過(guò)Affi-Gel blue親和層析、CM-Sephadex C-50弱陽(yáng)離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析三種分離技術(shù),從花生中分離純化出一種抗菌幾丁質(zhì)酶,純化倍數(shù)為46倍,回收率只有0.009%。造成本實(shí)驗(yàn)酶回收率較低的原因可能是，粗酶液中的部分雜蛋白和幾丁質(zhì)酶有相似的酶切作用,都可以產(chǎn)生N-NAG,使得粗酶液總活力很高,而經(jīng)過(guò)3步純化后,酶液中已不含有其他雜蛋白,總活力降低,導(dǎo)致回收率不高。另外蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)柱層析會(huì)被緩沖液稀釋,可通過(guò)冷凍濃縮富集之后再上樣,但缺點(diǎn)是比較耗時(shí)耗原料,應(yīng)盡可能在短時(shí)間的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)多次將樣品富集以提高純化倍數(shù)和回收率。

表1 克氏原螯蝦殼膜幾丁質(zhì)酶的純化結(jié)果Table 1 Purification of chitinase from shellfish of Procambarus clarkii

2.2 分子質(zhì)量和純度

SDS-PAGE顯示經(jīng)過(guò)DEAE收集的活性部分只含有1條蛋白帶,說(shuō)明幾丁質(zhì)酶已經(jīng)達(dá)到電泳純度,純化步驟完成,所得幾丁質(zhì)酶無(wú)亞基,為單體結(jié)構(gòu)(圖5)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,直線的方程為y=-1.38x+2.30。根據(jù)樣品的遷移率,可求得幾丁質(zhì)酶分子量約為36.8 kDa(圖6),與飛行質(zhì)譜檢測(cè)出的酶分子量37.7 kDa(圖7)相近。

圖5 克氏原螯蝦幾丁質(zhì)酶純化過(guò)程電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of chitinase from Procambarus clarkia注:M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1:粗酶液;2:30%～70%硫酸銨沉淀后酶液;3:G-100凝膠層析后酶活力峰;4:苯基疏水層析后酶活力峰;5:DEAE-陰離子層析后酶活力峰。

圖6 SDS-PAGE蛋白相對(duì)分子量對(duì)數(shù)與電泳相對(duì)遷移率關(guān)系圖Fig.6 Relation curve of lgMr and SDS-PAGE relative front

圖7 飛行質(zhì)譜測(cè)定幾丁質(zhì)酶分子量Fig.7 Determination of chitinase molecular weight by flight mass spectrometry

通常幾丁質(zhì)酶相對(duì)分子質(zhì)量在20～120 kDa之間,不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶相對(duì)分子量差異較大,已報(bào)道的蝦、蟹等甲殼類(lèi)動(dòng)物一般在30～70 kDa之間,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與羅氏沼蝦[16]肝胰腺中提取到的幾丁質(zhì)酶(38 kDa)和日本對(duì)蝦[14]肝臟中分離出的幾丁質(zhì)酶(37 kDa)分子質(zhì)量相當(dāng);但低于凡納濱對(duì)蝦[17]消化腺中的幾丁質(zhì)酶(50 kDa),中國(guó)對(duì)蝦[15]蝦頭幾丁質(zhì)酶(44.7kDa)以及脊尾白蝦[18]肝胰腺中的兩種幾丁質(zhì)酶(65、44 kDa);高于豐年蟲(chóng)[19]的幾丁質(zhì)酶(32 kDa);Lynn[20]在和克氏原螯蝦同屬十足目的美洲螯龍蝦胃液內(nèi)提取出三種分子量都為66 kDa的幾丁質(zhì)酶,說(shuō)明幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量大小會(huì)因種族、部位及其生活環(huán)境差異而各不相同。陳欣穎[21]從克氏原螯蝦內(nèi)臟中分離出一種N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶,測(cè)得該酶含有79.9、38.8 kDa兩條亞基,全酶分子量為118.66 kDa,幾乎是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)出的幾丁質(zhì)酶分子量的3倍,由此可見(jiàn)雖然同屬于一個(gè)物種的幾丁質(zhì)酶系,但不同的酶之間差距也非常大。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以克氏原螯蝦殼膜為提取材料,經(jīng)過(guò)勻漿抽提得到粗酶制劑,進(jìn)一步通過(guò)硫酸銨沉淀、G-100凝膠層析、苯基疏水層析、DEAE-32離子層析幾種不同的分離方法純化出了比活力為44.93 U/mg,純化倍數(shù)約16.28倍,酶回收率為2.98%的幾丁質(zhì)酶,SDS-PAGE顯示只有一條蛋白帶,表明幾丁質(zhì)酶已達(dá)到電泳純,該酶為單體結(jié)構(gòu),不含亞基,結(jié)合飛行質(zhì)譜測(cè)定出該幾丁質(zhì)酶為37.7 kDa。存在的問(wèn)題是回收率不高,純化步驟略繁瑣,但可為以后純化步驟提供有利條件,今后可考慮采用親和層析等其他方法進(jìn)行比較及改善,對(duì)純化路線的優(yōu)化有利于酶活的保持和幾丁質(zhì)酶純度的提高。在酶分離純化的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)G-100凝膠層析出現(xiàn)了三個(gè)酶活力峰,并且苯基疏水層析分離出有較弱的幾丁質(zhì)酶活性的酶活力峰,說(shuō)明可能有同工酶的存在,有待于進(jìn)一步的純化。酶的分離純化過(guò)程是對(duì)其接下來(lái)各種性質(zhì)等研究的分子基礎(chǔ),為進(jìn)一步探討酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶活性調(diào)控與克氏原螯蝦生長(zhǎng)發(fā)育、疾病及環(huán)境因素之間的相關(guān)性奠定重要的研究基礎(chǔ)。