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(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺(tái) 264025; 2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東煙臺(tái) 264025)

對(duì)羥基苯乙酰胺是合成腎上腺素受體阻滯藥阿替洛爾及其衍生物的關(guān)鍵中間體,因此對(duì)羥基苯乙酰胺的合成一直廣受關(guān)注[1-4]。對(duì)羥基苯乙酰胺的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。化學(xué)合成法反應(yīng)條件劇烈,需要強(qiáng)酸、高溫等條件,容易發(fā)生副反應(yīng)、收率低、污水難以處理、環(huán)境不友好,限制了在規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[5-6]。而生物轉(zhuǎn)化法通常常溫常壓下反應(yīng)、條件溫和、催化專一性強(qiáng)、對(duì)應(yīng)選擇性高,將會(huì)是工業(yè)生產(chǎn)對(duì)羥基苯乙酰胺的最佳選擇[7-9]。腈水合酶(Nitrile hydratase,NHase)是一種金屬酶,可以催化腈類物質(zhì)合成酰胺類化合物,是實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)對(duì)羥基苯乙酰胺的關(guān)鍵因素[10]。

NHase廣泛存在于微生物群體中,在紅球菌[11](Rhodococcussp.)、假單胞菌[12](Pseudomonassp.)、假諾卡氏菌[13](Pseudonocardiasp.)、農(nóng)桿菌[14](Agrobacteriumsp.)、芽孢桿菌[15](Bacillussp.)、棒桿菌[16](Corynebacteriumsp.)及短桿菌[17](Brevibacteriumsp.)等微生物中均有發(fā)現(xiàn),研究較為廣泛。Nitto公司采用3株產(chǎn)NHase的微生物生產(chǎn)丙烯酰胺,產(chǎn)量得到不斷提高。但也發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)NHase不穩(wěn)定,易失活,且受底物及產(chǎn)物的抑制作用較為強(qiáng)烈[18]。趙愛民等[19]利用篩選到的一株產(chǎn)NHase馬紅球菌(Rhodococcusequi),對(duì)其合成NHase的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,酶活較初篩時(shí)提高約95倍。馬士忠等[20]篩選出一株底物廣譜性的NHase的產(chǎn)生菌株諾卡氏菌KY1023,能高效地催化乙腈和丙烯腈的水解,分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺化合物,轉(zhuǎn)化率均超過98%。微生物NHase雖然具有很好的催化活性,在工業(yè)上僅限于丙烯酰胺和煙酰胺的生產(chǎn),仍未廣泛地應(yīng)用于其他腈類化合物,主要因?yàn)檫@些微生物NHase的酶活不夠高,半衰期短、對(duì)應(yīng)選擇性和反應(yīng)濃度不高,尚不具備工業(yè)價(jià)值[21]。通過篩選針對(duì)性底物的新型微生物NHase或可解決以上問題。

截至目前國內(nèi)外對(duì)阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)的開發(fā)利用較少,研究發(fā)現(xiàn)它可用作土壤益生菌和香草醛生產(chǎn)菌株,尚未見該菌產(chǎn)NHase的相關(guān)報(bào)道。本研究室從濟(jì)寧農(nóng)田土壤中分離出一株較高NHase活性的菌株,對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定和NHase酶學(xué)特性研究,為NHase的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及酶法制備酰胺化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微生物分離樣品 采集自濟(jì)寧農(nóng)田土壤;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物純化試劑盒 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Taq DNA聚合酶 TaKaRa公司;細(xì)菌微量生化鑒定管 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;豆粕水解液 山東陽成生物科技公司;其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

分離平板培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,對(duì)羥基苯乙腈4 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,MgSO40.1 g/L,KH2PO40.2 g/L,CoCl20.05 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0;斜面保藏培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,對(duì)羥基苯乙腈2 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母浸粉5 g/L,豆粕水解液10 g/L,MgSO40.1 g/L,硫酸銨2 g/L,KH2PO40.15 g/L,MgSO40.1 g/L,CoCl20.05 g/L,pH7.0。滅菌條件均為:121 ℃滅菌20 min。

LDZX-75KB高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;ZF-5手持式紫外燈 南京隆順儀器儀表有限公司;PCR儀 美國Bio-Rad公司;SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠;ZWY-111G恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;TGL-16B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)(色譜柱為Waters C18柱(250 mm×4.6 mm,10 μm)) 美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)NHase菌株的分離篩選 稱取采集到的土樣5 g溶于50 mL無菌水中,混勻后靜置沉降,取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，涂布于分離培養(yǎng)基平皿上,置于培養(yǎng)箱28 ℃條件下培養(yǎng)3 d,挑選單菌落接入含1 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板,28 ℃下220 r/min振蕩培養(yǎng)3 d,加入8 g/L的對(duì)羥基苯乙腈并調(diào)節(jié)pH為7.0轉(zhuǎn)化30 min,10000 r/min離心5 min,取2 μL上清液點(diǎn)樣于GF254硅膠板,層析展開1 h(正丁醇∶冰乙酸∶水=5∶1∶2),手持式紫外燈254 nm熒光顯色,觀察對(duì)羥基苯乙酰胺生成情況并挑選色斑大、顏色深的菌株進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩條件為:500 mL三角瓶裝50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基、28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h,發(fā)酵結(jié)束后10000 r/min離心5 min取上清液測定酶活力,挑選酶活力高的菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 菌株形態(tài)及生理生化鑒定 觀察復(fù)篩得到的菌株在分離培養(yǎng)基上的菌落表觀特征,同時(shí)對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色并觀察。對(duì)待測菌株進(jìn)行糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、丙二酸鹽利用、接觸酶試驗(yàn)和明膠液化等生理生化指標(biāo)測定,具體參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》[22]。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒抽提菌株的基因組DNA,以此為模板利用原核生物16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),反應(yīng)體系為25 μL,條件為:預(yù)變性94 ℃ 5 min;93 ℃ 45 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 70 s,30個(gè)循環(huán);延伸 8 min[23]。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì),選取相似性高且是有效發(fā)表的菌株序列,運(yùn)用MEGA 5.0的Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 酶活力測定 取1 mL,pH7.0、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含100 mmol/L對(duì)羥基苯乙腈),添加適量發(fā)酵液,25 ℃反應(yīng)20 min,立刻加入1 mL三氯乙酸終止反應(yīng)。10000 r/min離心20 min,HPLC測定對(duì)羥基苯乙酰胺含量。液相色譜條件為C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,10 μm),柱溫25 ℃;檢測波長:254 nm;流動(dòng)相:甲醇∶水∶四氫呋喃∶乙酸(35∶65∶1∶1,v/v),流速:1 mL/min[24]。酶活力定義:在pH7.0、溫度37 ℃的條件下,每1 min轉(zhuǎn)化生成1 μmol對(duì)羥基苯乙酰胺所需的酶量為1個(gè)酶活力單位U。

1.2.4 NHase的分離純化 發(fā)酵液12000 r/min離心20 min去除菌體,清液為粗酶液;加硫酸銨至飽和度為35%,4 ℃靜置4 h沉淀雜蛋白,高速離心機(jī)12000 r/min離心20 min,收集上清液;繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為60%,在4 ℃靜置4 h后,12000 r/min離心20 min,棄上清液收集沉淀。用pH7.0的Tris-HCl(0.05 mol/L)緩沖液復(fù)溶,透析,再經(jīng)DEAE-Sepharose離子交換層析、Sefinose TMCL-6B凝膠過濾層析純化后用于酶學(xué)性質(zhì)分析[7]。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.5.1 最適溫度及穩(wěn)定性測定 酶液分別在反應(yīng)溫度為25～70 ℃(梯度為5 ℃)、pH7.0條件下測定酶活力,以最高酶活力為100%,確定最適溫度。將酶液分別在25～60 ℃(梯度為5 ℃)、pH7.0下處理1 h后冰浴,取樣在最適反應(yīng)溫度下測定殘余酶活力,以未處理時(shí)酶活力為100%,研究酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.5.2 最適pH及穩(wěn)定性測定 將酶液分別在pH為4.0～9.5(梯度為0.5)的50 mmol/L緩沖溶液配制的催化體系反應(yīng),底物濃度為100 mmol/L,在50 ℃條件下反應(yīng),設(shè)最高酶活力為100%,確定NHase的最適反應(yīng)pH。將酶液分別在pH為4.0～9.0(梯度為0.5)的緩沖溶液體系中4 ℃處理1 h,取樣在50 ℃、最適反應(yīng)pH下測定剩余酶活力,以未處理時(shí)酶活力為100%,研究NHase的pH穩(wěn)定性。

1.2.5.3 金屬離子對(duì)酶活力影響 在酶反應(yīng)體系中分別加入1 mmol/L的Fe2+、Cu2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Al3+、Ca2+、Fe3+、Mn2+金屬離子化合物,在50 ℃、pH7.0條件下催化反應(yīng),以未加金屬離子的酶反應(yīng)體系為參照,酶活力設(shè)為100%,研究不同金屬離子對(duì)NHase活力的影響。

1.2.5.4 米氏常數(shù)的測定 將酶液分別與0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mM濃度的對(duì)羥基苯乙腈底物溶液在50 ℃、pH7.0條件下反應(yīng)6 min,通過測定酶活力計(jì)算酶的反應(yīng)初速度,通過米氏方程的雙倒數(shù)形式(Lineweaver-Burk plot)計(jì)算酶的Km及Vmax。

1.2.5.5 底物特異性測定 分別選100 mmol/L的對(duì)羥基苯乙腈、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯乙腈、2-氨基丁腈、苯甲腈、苯丙腈為底物與酶反應(yīng),測定酶活力,以對(duì)羥基苯乙腈為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,酶活力設(shè)為100%,研究酶的底物特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)NHase菌株的分離

由圖1可知,以對(duì)羥基苯乙腈為誘導(dǎo)物和底物,在分離培養(yǎng)基上稀釋涂布挑選單菌落,接種到96孔板發(fā)酵初篩,加對(duì)羥基苯乙腈轉(zhuǎn)化30 min,用TLC法檢測催化產(chǎn)物對(duì)羥基苯乙酰胺,通過比移值和產(chǎn)物色度分析,對(duì)菌株產(chǎn)生NHase的能力做初步的評(píng)判,初篩得到的18株菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,培養(yǎng)結(jié)束后測定發(fā)酵液酶活力，發(fā)現(xiàn)菌株Jn-102產(chǎn)酶效果最佳,酶活力達(dá)到3.6 U/mL,進(jìn)一步對(duì)該菌株進(jìn)行種屬鑒定和NHase酶學(xué)特性研究。

圖1 菌株Jn-102轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TLC檢測Fig.1 TLC test of transformation products from strain Jn-102注：1:對(duì)照;2、3：Jn-102菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

2.2 菌株Jn-102的鑒定

2.2.1 菌體及菌落形態(tài)及生理生化指標(biāo)鑒定 Jn-102菌株在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)結(jié)果如圖2A所示,菌落呈乳白或微黃色、近圓形、培養(yǎng)16 h菌落光滑濕潤、24 h菌落表面干燥有褶皺、邊緣不規(guī)則,易挑取;顯微鏡觀察結(jié)果如圖2B所示,菌體細(xì)胞呈桿狀、多數(shù)單個(gè)分散存在、個(gè)別分裂后不斷裂,革蘭氏陽性,培養(yǎng)72 h后觀察芽孢著生在菌體側(cè)端位置,橢圓形或柱形。生理生化檢測結(jié)果表明,菌株Jn-102 VP試驗(yàn)、氧化酶、觸酶、脲酶、酯酶及磷酸酶試驗(yàn)陽性,甲基紅、吲哚試驗(yàn)陰性,能同化多數(shù)糖醇,不能利用鼠李糖和山梨醇,5% NaCl培養(yǎng)基中生長良好,試驗(yàn)結(jié)果詳見表1。依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》,結(jié)合上述試驗(yàn)結(jié)果,將菌株Jn-102初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

圖2 菌株Jn-10216h和24 h的菌落形態(tài)(A)及革蘭氏染色結(jié)果(B)(×1000)Fig.2 Colony morphological characteristics(A)and gram staining(B)of strain Jn-102(×1000)

表1 菌株Jn-102的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characters of bacillus strain Jn-102

2.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)測序確定菌株Jn-102 16S rDNA序列長度為1382 bp,提交基因序列信息到NCBI GenBank,得到登錄號(hào)MF990906,選取與其同源性高且已定名菌株的相關(guān)序列信息,用ClustalX 1.83進(jìn)行序列比對(duì),用MEGA 5.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖3所示,可以看出菌株Jn-102和Bacillusaryabhattai的遺傳進(jìn)化距離最近,與已知菌株Bacillusaryabhattai(EF114313)的同源性達(dá)到99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性指標(biāo),鑒定菌株Jn-102為阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)。

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences simility of selected strains注：節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示bootstrap支持率,1000次重復(fù)。

2.3 NHase的分離純化

BacillusaryabhattaiJn-102 NHase純化結(jié)果如表2所示,最終得到NHase的回收率為20.1%,純化倍數(shù)為13.9 倍,比活力355.98 U/mg。

表2 Bacillus aryabhattai Jn-102 NHase分離純化結(jié)果Table 2 Summary of the purification steps of NHase from Bacillus aryabhattai Jn-102

2.4 酶學(xué)特性分析

2.4.1 最適溫度及穩(wěn)定性測定 由圖4A可以看出,BacillusaryabhattaiJn-102產(chǎn)生的NHase的最適反應(yīng)溫度為50 ℃,并在35～50 ℃范圍內(nèi)均具有較高的酶活力,當(dāng)溫度低于35 ℃時(shí),酶活力隨溫度升高明顯上升,超過50 ℃酶活力迅速降低。該酶的熱穩(wěn)定性研究表明,溫度低于40 ℃時(shí)該酶穩(wěn)定性良好,保溫1 h仍保留95%以上的活性,溫度超過40 ℃時(shí),酶活性變得不穩(wěn)定,極易失活(圖4B)。

圖4 溫度對(duì)酶活力及酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of nitrile hydratase

2.4.2 最適pH及穩(wěn)定性測定 測得NHase在不同pH下的酶活力,結(jié)果見圖5A,圖中顯示該酶催化反應(yīng)的pH在6.5～7.5之間活力均較高,其最適反應(yīng)pH為7.0,當(dāng)pH在6.5以下或7.5以上時(shí),酶活力下降較快。酶的穩(wěn)定性驗(yàn)證如圖5B所示,該酶在pH6.0～8.0的條件下保存1 h后仍保留85%以上的酶活力,可見在此pH范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性較高,而pH低于或高于此pH范圍時(shí)，酶活力均出現(xiàn)較為明顯的降低。

圖5 pH對(duì)酶活力及酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of nitrile hydratase

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活力影響 NHase一般為金屬酶,金屬離子和酶活性密切相關(guān)。金屬離子對(duì)NHase酶活力影響結(jié)果如表2所示,Co2+和Mg2+對(duì)NHase酶活力有輕微激活作用,但作用不明顯,和對(duì)照組相當(dāng)。而其他金屬離子對(duì)酶活均有著不同程度的抑制作用,其中Zn2+的抑制作用最強(qiáng)烈,酶活力剩余68.3%。

表2 金屬離子對(duì)卡拉膠酶活性的影響Table 2 Metal ions on nitrile hydratase activity

2.4.4 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定 由圖6可知,BacillusaryabhattaiJn-102的NHase水解對(duì)羥基苯乙腈符合米氏動(dòng)力學(xué)方程,經(jīng)計(jì)算酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km=21.3 mmol/L,最大反應(yīng)速率Vmax=60.2 μmol/(min·mg)。Jn-102的NHase對(duì)對(duì)羥基苯乙腈顯示出較高的親和力,Km低于已有文獻(xiàn)的報(bào)道[7-12]。

圖6 雙倒數(shù)法測定Bacillus aryabhattai Jn-102的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.6 Kinetic parameters determination of nitrile hydratase from Bacillus aryabhattai Jn-102 by Lineweaver-Burk plot

2.4.5 底物特異性測定 底物特異性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示,NHase對(duì)于受試的7種腈類底物均能發(fā)生水合作用，形成相應(yīng)的酰胺化合物,沒有嚴(yán)格的底物特異性,尤其對(duì)3-氰基吡啶和4-氰基吡啶催化活性較高,相對(duì)酶活達(dá)到對(duì)羥基苯乙腈的200%以上,但對(duì)苯甲腈、2-氨基丁腈的活性較低。

表3 菌株Jn-102產(chǎn)腈水合酶的底物特異性Table 3 Substrate specificity of nitrile hydratase from Jn-102

3 結(jié)論

本研究自濟(jì)寧農(nóng)田土壤中分離到產(chǎn)NHase活力較高的菌株Jn-102,經(jīng)分子生物學(xué)、生理生化及形態(tài)學(xué)特征鑒定為阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)。對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果表明酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為50 ℃和7.0,在40 ℃以下和pH6.0～8.0范圍內(nèi)酶活力較穩(wěn)定,具有較寬的底物譜,對(duì)芳香腈有較好的水合作用,以對(duì)羥基苯乙腈為底物時(shí)，Km值和Vmax值分別為21.3 mmol/L和60.2 μmol/(min·mg),Co2+和Mg2+等對(duì)酶活力有輕微的促進(jìn)作用,而Zn2+對(duì)酶活力有強(qiáng)烈的抑制作用。這些性質(zhì)不同于以往報(bào)道的NHase,具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景,為今后進(jìn)一步研究NHase在制備酰胺化合物中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐和研究基礎(chǔ)。