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(1.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,綠色化學(xué)工程技術(shù)研究中心,上海 201210; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049; 3.上海科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 201210)

α-淀粉酶根據(jù)最適作用溫度的不同可分為低溫、中溫和高溫淀粉酶三個(gè)類型,其中,來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的中溫α-淀粉酶是目前應(yīng)用廣泛的一種淀粉液化酶。早在上世紀(jì)60年代,我國(guó)就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了中溫α-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn), 主要是由解淀粉芽孢桿菌BF7658及其突變菌株或重組菌株生產(chǎn)獲得[1-2],主要應(yīng)用于造紙、織造、淀粉加工等領(lǐng)域[3]。通過(guò)菌種優(yōu)化提高酶的生化性能或菌株的生產(chǎn)能力,降低經(jīng)濟(jì)成本,一直都是研究淀粉酶的主要策略。近幾十年來(lái),由于耐高溫淀粉酶市場(chǎng)需求的持續(xù)增長(zhǎng),國(guó)內(nèi)對(duì)于中溫淀粉酶的研究較少,其中,劉洋等[1]研究人員通過(guò)分子克隆的方法實(shí)現(xiàn)了淀粉酶編碼基因amyQ(來(lái)源于B.amyloliquefaciensCICIM B2135)在E.coli和B.subtilis中的異源表達(dá),而且通過(guò)多拷貝質(zhì)粒pLY-amyQ的轉(zhuǎn)化得到了新的重組菌株,并且在搖瓶水平上,將中溫淀粉酶的分泌能力提高了50%。

芽孢桿菌具有自然界中廣泛存在[4]、細(xì)胞壁中不含內(nèi)毒素、能分泌大量胞外蛋白且易于分離等多種優(yōu)良特性,因此,世界上大約50%的酶制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)都依賴于芽孢桿菌的自身或者異源表達(dá)[5-6],其中以解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為代表。解淀粉芽孢桿菌是獲得食品工業(yè)酶生產(chǎn)許可的安全微生物之一[7],隨著其模式菌株FZB42全基因組測(cè)序的完成[8],對(duì)其相關(guān)代謝機(jī)理研究已經(jīng)進(jìn)入分子層面。地衣芽孢桿菌與其他芽孢桿菌相比,多存在于較惡劣的環(huán)境中[9],蛋白分泌能力強(qiáng),約為枯草芽孢桿菌的20倍,異源表達(dá)水平可達(dá)到20～25 g·L-1[10]。目前,這兩種菌株由于外源DNA轉(zhuǎn)化效率較低的限制而未得到充分的應(yīng)用。相關(guān)研究表明外源DNA的轉(zhuǎn)化可能受到菌株內(nèi)存在的DNA限制修飾系統(tǒng)的影響[11],通過(guò)PubMed的解淀粉芽孢桿菌和測(cè)序得到的實(shí)驗(yàn)室1398菌株的基因數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示都存在一種Type IV R-M(Mrr)限制修飾系統(tǒng),而在枯草芽孢桿菌的模式菌株168和164中卻不存在。本研究將針對(duì)解淀粉芽孢桿菌轉(zhuǎn)化的問(wèn)題,通過(guò)分子生物學(xué)操作和甲基化修飾策略，將其改造為合適生產(chǎn)中溫淀粉酶的菌株，并為其他芽孢桿菌的改造提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株與質(zhì)粒 見(jiàn)表1,芽孢桿菌菌株包括解淀粉芽孢桿菌1398和枯草芽孢桿菌164s以及地衣芽孢桿菌Jbac均為實(shí)驗(yàn)室分離或改造的實(shí)驗(yàn)菌株。其中,164s是實(shí)驗(yàn)室對(duì)模式枯草芽孢桿菌164進(jìn)行感受態(tài)改造后獲得的高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)菌株。實(shí)驗(yàn)所用的引物及擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物名稱見(jiàn)列表2?；蚪MDNA提取試劑盒、PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒小劑量提取試劑盒等 杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;DNA聚合酶 PrimerStar、限制性內(nèi)切酶DpnI Takara公司。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

主要實(shí)驗(yàn)儀器有S1000TMPCR擴(kuò)增儀、Gel DocTMXR+全自動(dòng)凝膠成像儀、MicroPulser電轉(zhuǎn)儀和Tanon EPS30電泳槽 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限責(zé)任公司;MLS-3780立式蒸汽滅菌器 日本三洋儀器公司;WFJ 2100紫外分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;5430R高速冷凍離心機(jī) 艾本德生命科學(xué)儀器有限公司;ZSD-A1160A恒溫培養(yǎng)箱、ZWY-2102C恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 菌體活化培養(yǎng)等所用培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基(g/L):氯化鈉 10,胰蛋白胨10,酵母浸取物5,用去離子水定容。

芽孢桿菌電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基包括菌體富集培養(yǎng)基、電轉(zhuǎn)洗滌培養(yǎng)基和復(fù)蘇培養(yǎng)基三種,其中菌體富集培養(yǎng)基(g/L):磷酸氫二鉀17.4,氯化鈉 11.6,葡萄糖5,胰蛋白胨5,酵母浸取物1,檸檬酸鈉0.3,七水硫酸鎂 0.05,山梨醇91.1;電轉(zhuǎn)洗滌培養(yǎng)基(g/L):山梨醇91.1,甘露醇91.1,海藻糖171.1,10%(V/V%)的甘油;復(fù)蘇培養(yǎng)基(g/L):磷酸氫二鉀17.4,氯化鈉 11.6,葡萄糖5,胰蛋白胨5,酵母浸取物1,檸檬酸鈉0.3,七水硫酸鎂 0.05,山梨醇91.1,甘露醇69.5。發(fā)酵用淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基(g/L):75%的麥芽糖漿50,葡萄糖20,玉米漿20,磷酸二氫鉀12,硫酸銨14,硫酸鎂0.4,尿素2,酵母粉2;除電轉(zhuǎn)洗滌培養(yǎng)基用雙蒸水配制,其他培養(yǎng)基都用去離子水配制。

枯草芽孢桿菌164s誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為含1%(w/v)木糖的LB培養(yǎng)基。

用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化子篩選的氨芐青霉素(Amp)濃度為100 μg/mL,而用于芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子篩選的紅霉素(Erm)濃度為10 μg/mL。

1.2.2 試劑和溶液配制 原碘液,分別稱取碘(I2)11.0 g、碘化鉀(KI)22.0 g,然后用少量的水使碘和碘化鉀完全溶解,并用去離子水定容至500 mL,儲(chǔ)存于棕色試劑瓶中待用;

稀碘液,稱取碘化鉀20 g用水溶解,然后用移液槍加入原碘液2.00 mL,并定容至500 mL,儲(chǔ)存于棕色試劑瓶中待用;

20 g/L可溶性淀粉溶液,將85 ℃下烘2～3 h的可溶性淀粉10.000 g,倒入燒杯中,用水調(diào)制成漿狀物,在電磁攪拌器下并加水約400 mL,加熱沸騰2～3次至完全透明,冷卻,定容至500 mL(此溶液需要當(dāng)天配制);

磷酸緩沖液(pH=6.0)稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)45.23 g、檸檬酸(C6H8O7·H2O)8.07 g,用水溶解并定容至1000 mL。配好后用pH計(jì)測(cè)定并調(diào)節(jié)。

1.2.3 感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化采用氯化鈣法[13],而1398和Jbac在電擊轉(zhuǎn)化方法[14-15]上進(jìn)行如下改良,主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面,一,將感受態(tài)制備中菌體洗滌用的無(wú)菌水換成具有高滲透壓的海藻糖電轉(zhuǎn)洗滌培養(yǎng)基;二,復(fù)蘇過(guò)程中培養(yǎng)基同樣使用高滲透性的山梨醇-甘露醇培養(yǎng)基。具體方法如下:

單菌落1398和Jbac接到3 mL LB試管中,37 ℃,200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)10～12 h;取2.4 mL 菌液接到40 mL富集培養(yǎng)基的三角搖瓶(250 mL)中,37 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng)直到OD600長(zhǎng)到0.6～0.8時(shí),取出置于冰上處理20 min,然后倒入無(wú)菌離心管(50 mL)中,4 ℃,6000 r/min離心8 min收集菌體,倒掉上清后,加入約30 mL預(yù)冷的電轉(zhuǎn)洗滌培養(yǎng)基,并用移液槍輕輕吹打均勻,并輕微搖勻,繼續(xù)4 ℃,6000 r/min離心8 min,去上清,重復(fù)此操作2～3次,用最后一次管壁殘余的少許洗滌培養(yǎng)基吹打菌體,混勻,即為感受態(tài)細(xì)胞懸液,用提前預(yù)冷的槍頭分裝到1.5 mL Ep離心管中,每管60 μL感受態(tài)細(xì)胞懸液。加入1 μg質(zhì)粒,混勻,冰上靜置5 min,然后加入電轉(zhuǎn)杯(2 mm),在設(shè)定電壓為2.5 kV的電轉(zhuǎn)化儀器上點(diǎn)擊一次,迅速加入500 mL 復(fù)蘇培養(yǎng)基,然后轉(zhuǎn)移到Ep管中,37 ℃,200 r/min復(fù)蘇3 h左右,涂到對(duì)應(yīng)的抗性平板培養(yǎng)基。

164s的木糖誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法:將單克隆菌株164s轉(zhuǎn)接到LB試管中,過(guò)夜培養(yǎng)8～12 h,吸取62 μL的木糖溶液加入到一支新鮮的LB試管中,37 ℃預(yù)熱5 min,然后加入300 mL的164s菌液,37 ℃,200 r/min,培養(yǎng)3 h左右,即可形成感受態(tài)細(xì)胞,接著用2.0 mL的無(wú)菌Ep管分裝,每管500 mL,加入1 μg質(zhì)粒,并加入500 mL 新鮮LB培養(yǎng)基,混勻后,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)2 h,涂布與之相對(duì)應(yīng)抗性的LB平板,用以篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建 表達(dá)GFP的質(zhì)粒pMK4-1398P-gfp構(gòu)建來(lái)自課題組前期實(shí)驗(yàn)[16]。在pMK4E的基礎(chǔ)之上,本文通過(guò)合成兩對(duì)引物P1/P2和P5/P6分別擴(kuò)增出pMK4片段和erm(紅霉素抗性基因)片段,然后通過(guò)Overlap PCR的方法得到pMK4E質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)erm替換原來(lái)pMK4質(zhì)粒中的cm(氯霉素抗性基因)片段。從課題組篩選的解淀粉芽孢桿菌LT的基因組上通過(guò)引物P3/P4擴(kuò)增出中溫淀粉酶dx片段,然后用P5/P6擴(kuò)增出線性載體pMK4E片段,然后用一步克隆法[17]轉(zhuǎn)化164s得到pMK4E-dx,構(gòu)建流程如圖1所示。

1.2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 本研究將課題組以前構(gòu)建的質(zhì)粒pMK4-1398P-gfp[16]和pMK4E依次經(jīng)過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化JM110和甲基化處理,并將500 ng甲基化處理的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化解淀粉芽孢桿菌1398和地衣芽孢桿菌Jbac,并以164s中提取出的甲基化修飾質(zhì)粒(pMK4-1398P-gfp和pMK4E)為對(duì)照,分別通過(guò)熒光顯色和Erm抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

為進(jìn)一步驗(yàn)證這種方法,本研究通過(guò)overlap的方法構(gòu)建了一個(gè)帶有淀粉酶基因dx的重組質(zhì)粒pMK4E-dx(如圖1所示),通過(guò)轉(zhuǎn)化164s菌株,得到了帶有重組質(zhì)粒的菌株,將164s中的重組質(zhì)粒pMK4E-dx(164s來(lái)源)提取出來(lái),分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM110和DH5α,得到未經(jīng)過(guò)甲基化修飾的質(zhì)粒pMK4E-dx(JM110來(lái)源)和甲基化修飾的質(zhì)粒pMK4E-dx(DH5α來(lái)源),通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法將未甲基化的質(zhì)粒pMK4E-dx和甲基化的質(zhì)粒pMK4E-dx轉(zhuǎn)入到解淀粉芽孢桿菌LT(實(shí)驗(yàn)室分離出來(lái)的一株解淀粉芽孢桿菌)中。

圖1 質(zhì)粒pMK4E-dx的構(gòu)建過(guò)程Fig.1 Construction of plasmid pMK4E-dx注:bla,氨芐抗性基因(amp)片段;cat,氯霉素抗性基因(cm)片段。

1.2.6 中溫淀粉酶搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 將LT-J1和LT-J2以及LT的單克隆菌株接入LB試管中,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)10～12 h后,吸取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到100 mL(500 mL三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中,以LT菌株為對(duì)照組,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)24 h,然后12000 r/min離心2 min,吸取上清即為粗酶液。

1.2.7 淀粉酶活測(cè)定方法 根據(jù)GB/T18932.16[18]規(guī)定，1 g固體酶粉(或1 mL液體酶),于60 ℃、pH6.0的條件下,1 h液化1 g可溶性淀粉,即為1個(gè)酶活力單位,以U/g(U/mL)表示。吸取可溶性淀粉20.0 mL于試管中,加入緩沖液5.00 mL,搖勻后,水浴鍋中60 ℃恒溫預(yù)熱5 min;將發(fā)酵液稀釋10、50、100倍,(使測(cè)得的酶活力在3.7～5.6 U/mL之間),加入稀釋好的待測(cè)酶液1.00 mL,立即用秒表記錄時(shí)間,準(zhǔn)確反應(yīng)5 min;立即吸取反應(yīng)液1.00 mL于稀碘液5.00 mL中,搖勻,并以稀碘液做空白對(duì)照,倒入10 mm比色皿,用紫外分光光度計(jì)迅速測(cè)定其吸光度。根據(jù)吸光度查附表(見(jiàn)GB/T18932.16),可以得到待測(cè)酶液的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 Jbac、1398菌株的基因組信息分析

對(duì)解淀粉芽孢桿菌1398、地衣芽孢桿菌Jbac和PubMed上BLAST的解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對(duì)(如圖2所示),發(fā)現(xiàn)都存在一種限制修飾系統(tǒng)(R-M)—— Mrr(Methylated adenine recognition and restriction,Type IV)。當(dāng)這些菌株的細(xì)胞攝取外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,由于質(zhì)粒上的甲基化標(biāo)記會(huì)被這些限制修飾系統(tǒng)識(shí)別，激活降解外源DNA的信號(hào)通路,從而導(dǎo)致外源DNA很難導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),因此導(dǎo)致了許多芽孢桿菌很難進(jìn)行遺傳操作的現(xiàn)狀。

圖2 三種不同芽孢桿菌修飾系統(tǒng)IV編碼蛋白的序列比對(duì)Fig.2 The multialignment analysis of type IV modification enzymes’ peptide sequences in three different Bacillus strains注:圖左側(cè)分別以1398,B.Amyloliquefaciens,Jbac分別表示各自菌株中的IV型限制修飾系統(tǒng)相關(guān)基因。

2.2 pMK4-1398P-gfp轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌Jbac和解淀粉芽孢桿菌1398

經(jīng)甲基化試劑處理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入解淀粉芽孢桿菌1398后，得到了4個(gè)轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌Jbac后，得到了6個(gè)轉(zhuǎn)化子;作為對(duì)照,使用從枯草芽孢桿菌164s細(xì)胞中直接提取的相同質(zhì)粒(未經(jīng)甲基化酶處理)在轉(zhuǎn)化1398或Jbac均未獲轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子通過(guò)Colony PCR 驗(yàn)證,如圖3(a)所示，Jbac轉(zhuǎn)化子陽(yáng)性率為100%,而解淀粉芽孢桿菌1398轉(zhuǎn)化子通過(guò)熒光檢驗(yàn),結(jié)果如3(b)所示,出現(xiàn)熒光現(xiàn)象的表示為質(zhì)粒轉(zhuǎn)入成功,反之則表示沒(méi)有轉(zhuǎn)入,Colony PCR驗(yàn)證后,如圖3(c)所示,陽(yáng)性率為75%。

圖3 分別轉(zhuǎn)化pMK4E質(zhì)粒和GFP表達(dá)質(zhì)粒到地衣芽孢桿菌J.bac和解淀粉芽孢桿菌1398的轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.3 Transformation of plasmid pMK4E and GFP-expressing plasmids into B.licheniformis J.bac and B. amyloliquefaciens 1398 respectively注:a,c分別為轉(zhuǎn)化后PCR驗(yàn)證的電泳圖,其中M表示Marker,C表示對(duì)照組control;圖a中1～6表示挑選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的編號(hào),目的條帶Erm為1143 bp;b為菌落熒光圖,顏色亮的表示有熒光,反之則沒(méi)有。圖c中1～4表示陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的編號(hào),目的條帶comk為2567 bp。

2.3 重組淀粉酶dx在解淀粉芽孢桿菌LT中的表達(dá)

以DH5α來(lái)源的pMK4E-dx質(zhì)粒作為對(duì)照,其中轉(zhuǎn)入未甲基化的質(zhì)粒pMK4E-dx,得到是三個(gè)轉(zhuǎn)化子,而轉(zhuǎn)入DH5α來(lái)源的質(zhì)粒都沒(méi)有得到轉(zhuǎn)化子,通過(guò)試管培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，三個(gè)轉(zhuǎn)化子中只有兩個(gè)能提取出質(zhì)粒,這兩株菌分別記為L(zhǎng)T-J1、LT-J2。

將得到的兩株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵并測(cè)定重組酶活,結(jié)果如圖4所示,兩株轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)中溫淀粉酶DX的重組菌，其分泌表達(dá)的酶活大大高于原有宿主生產(chǎn)菌株,酶活分別達(dá)到145.9 U/mL(LT-J1)和153.6 U/mL(LT-J2),為原菌株發(fā)酵淀粉酶活的3.65和3.84倍,證實(shí)了新的策略成功地實(shí)現(xiàn)野生型芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化,提升了原有解淀粉芽孢桿菌LT的中溫淀粉酶生產(chǎn)能力,這種新的轉(zhuǎn)化策略不僅可以應(yīng)用到對(duì)該菌后續(xù)的分子改造研究中,還可能會(huì)被應(yīng)用到其它轉(zhuǎn)化率低的野生型芽孢桿菌中。

圖4 中溫淀粉酶dx在解淀粉芽孢桿菌LT中的表達(dá)Fig.4 Expression of midrange thermal stable amylase dx in Bacillus amyloliquefaciens注:LT:野生型的解淀粉芽孢桿菌;LT-J1、LT-J2:轉(zhuǎn)入pMK4E-dx質(zhì)粒的LT菌株。

3 結(jié)論

基于三株芽孢桿菌的基因組序列分析,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在相同的限制修飾系統(tǒng)——IV型限制修飾系統(tǒng)(Mrr),其攜帶的IV型DNA限制性內(nèi)切酶是模式枯草芽孢桿菌168及164所沒(méi)有的,因而可能是兩種微生物轉(zhuǎn)化效率特別低的原因之一。針對(duì)這一情況,我們分別用未甲基化的質(zhì)粒和甲基化的質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn),并且優(yōu)化了電轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程,結(jié)果表明，未經(jīng)過(guò)甲基化修飾的外源DNA更容易轉(zhuǎn)化到芽孢桿菌中,同時(shí)我們還利用新開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)化方法,將構(gòu)建的表達(dá)重組中溫淀粉酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到解淀粉芽孢桿菌LT中,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng),測(cè)得LT-J1和LT-J2的酶活為145.9 U/mL和153.6 U/mL,是原生產(chǎn)菌株的3.65倍和3.84倍,為后續(xù)的中溫淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)菌株的工程改造及發(fā)酵優(yōu)化奠定了很好的研究基礎(chǔ)。