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(大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,云南大理 671000)

地參(LycopuslucidusTurcz.)唇形科地筍屬,又名蟲草參[1],中藥名叫“澤蘭”,藥食兼用[2],含有人體所需的各種氨基酸、微量元素、糖類、等多種營養(yǎng)成分及多酚、皂苷和多糖等生物活性成分[3-4];且臨床研究發(fā)現(xiàn),地參有降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化和減肥等多種保健功能[5-9]。

α-葡萄糖苷酶是存在于小腸絨毛上皮細(xì)胞刷狀緣膜上的寡糖水解酶,可使碳水化合物結(jié)構(gòu)中的α-1,4糖苷鍵斷裂將其水解為葡萄糖。通過抑制α-葡萄糖苷酶活性,可延緩或阻礙葡萄糖的生成或吸收,來降低餐后血糖峰值[10-12]。胰脂肪酶是脂肪在水解過程中的關(guān)鍵酶,通過抑制其水解膳食脂肪,減少食物脂肪因降解為單甘油酯、甘油二酯、甘油和脂肪酸而被人體吸收,從而達(dá)到預(yù)防肥胖的效果[13-15]。植物多酚對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶具有顯著的抑制作用,且來源廣泛、毒副作用小[16-17]。黃菊華等[3]研究表明,地參多酚具有顯著抗氧化活性。劉莉等[18-21]研究指出,植物多酚類物質(zhì)能有效的抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的活性,但關(guān)于地參結(jié)合酚降糖降脂的研究尚未見報道。本文以地參結(jié)合酚提取物對體外消化酶的抑制率為指標(biāo),研究地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制作用,以期為地參的進(jìn)一步加工利用與相關(guān)抗糖尿病和減肥功能食品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地參樣品 分別于2016年11月16日(T1)、2016年12月15日(T2)和2017年1月14日(T3)三個采收期,采于云南省大理白族自治州劍川縣沙溪鎮(zhèn)的四聯(lián)村(S1)和江尾村(S2)兩個采收地,采集新鮮完整、無破損的地參原料,清洗,冷凍干燥(溫度:-51 ℃),粉碎過60目篩,4 ℃貯藏備用;α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶、對硝基苯-α-D-半乳糖吡喃糖苷(PNPG)、4-甲基傘形酮油酸酯(4-MUO)等 購自Sigma公司;其余試劑 均為分析純。

SK8210HP 超聲波清洗器 上海科尼超聲儀器有限公司;RE-5298 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;恒溫水浴箱 金壇市大地自動化儀器廠;Scientz-ND 型系列真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;WFJ 2000 型可見光分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司;F96pro 熒光分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;Agilent 1200 型高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 地參結(jié)合酚提取物的提取 參考Xu等[22]的方法,略作修改。準(zhǔn)確稱取地參粉末5 g,用80%的甲醇按料液比1∶20 (w/v),超聲波(頻率:59 kHz,溫度:室溫;時間:10 min)輔助提取3次,抽濾去除溶劑,殘渣加入35 mL 4 mol/L NaOH溶液(含10 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)和1%抗壞血酸),室溫暗室水解反應(yīng)4 h,反應(yīng)結(jié)束后,用6 mol/L HCl將pH調(diào)至1～2,真空抽濾,濾液用乙酸乙酯萃取5次(每次15 mL),合并乙酸乙酯相,35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯。將濃縮液置于50 mL離心管,蒸餾水定容至15 mL,定義為地參結(jié)合酚粗提取物。

1.2.2 地參結(jié)合酚提取物的純化 參照金瑩等[23]的方法,略加修改。稱取一定量已處理的X-5大孔樹脂加入到地參結(jié)合酚粗提取液中,水浴振蕩(25 ℃,120 r/min)24 h,抽濾,將吸附了酚類物質(zhì)的大孔樹脂置于50 mL離心管,加入15 mL 70%乙醇,水浴振蕩(25 ℃,120 r/min)24 h,抽濾,濾液40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,濃縮液冷凍干燥(溫度:-51 ℃),得地參結(jié)合酚提取物。

1.2.3 地參結(jié)合酚提取物酚含量的測定 參考陳磊等[24]的方法,略作修改。以沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=0.0965x+0.0974(0～6.4 μg/mL),R2=0.9917。樣品中酚含量測定結(jié)果以微克沒食子酸等量每毫克提取物干重表示(μg GAE/mg)。

1.2.4 地參結(jié)合酚提取物的HPLC分析 參考高紅兵等[25]的方法,并略作修改。采用高效液相色譜法(HPLC)對地參結(jié)合酚提取物的組成進(jìn)行分析。Agilent ZORBAX SB-C 18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL;檢測波長為320 nm。流動相A:100%色譜甲醇,流動相B:冰乙酸/色譜甲醇/超純水溶液,1/10/89(v/v/v)。梯度洗脫程序如下:0～1 min:A 20%,1～16 min:A 20%升至38%,16～18 min:A 38%,18～30 min:A 38%升至60%,30～35 min:A 60%,35～40 min:A 60%降至20%,40～43 min:A 20%。

以咖啡酸和迷迭香酸做標(biāo)準(zhǔn)品,得咖啡酸回歸方程為y=46.1790x+136.8550(10～50 μg/mL),R2=0.9940;迷迭香酸回歸方程為y=20.67x-93.06(10～50 μg/mL),R2=0.9989。

1.2.5 地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用 參考Kim等[26-27]的方法,略作修改。0.1 mL不同濃度(1、2、3、4、5 mg/mL)的樣品與0.1 mLα-葡萄糖苷酶(1.25 U/mL)充分混勻,加入0.1 mL PNPG(1.5 mmol/mL,pH7.4),37 ℃水浴15 min,加入3 mL的碳酸鈉溶(1 mol/L)終止反應(yīng),在400 nm處測定吸光度值。本底管和對照管中的PNPG和樣品均用0.1 mL的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.4)代替。地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率用下式計算:

式中:A1為樣品管的吸光度值;A2為本底管的吸光度值;A3為對照管的吸光度值。

1.2.6 地參結(jié)合酚提取物對胰脂肪酶的抑制作用 參考張兵[28]、Liang[29]等的方法,略作修改。取0.1 mL 4-MUO(0.1 mmol/L)、0.04 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(0.1 mol/L,pH7.4),與0.1 mL不同濃度(0.5、1、2、4、8 mg/mL)的樣品充分混勻后,加入0.05 mL胰脂肪酶(0.05 U/mL),37 ℃水浴20 min,依次加入1 mL鹽酸(0.1 mol/L)和2 mL檸檬酸鈉(0.1 mol/L)終止反應(yīng)。對照管中的樣品用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液代替,于激發(fā)波長365 nm,發(fā)射波長350 nm處測定熒光值。地參結(jié)合酚提取物對胰脂肪酶的抑制率用下式計算:

式中:A1為樣品管的吸光度值;A2為對照管的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 地參結(jié)合酚提取物的酚含量

地參結(jié)合酚提取物酚含量見表1。就S1采收的地參而言,三個采收期之間酚含量無顯著性差異;就S2采收的地參而言,T2采收期酚含量顯著高于T1和T3(p<0.05)。酚類化合物的合成代謝途徑中涉及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、酪氨酸氨基輕移酶(TAT)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)、多酚氧化酶(PPO)等多種酶。有文獻(xiàn)報道,輻照[30]、農(nóng)藥[31]、真菌和昆蟲的攻擊[32]、誘導(dǎo)子和低溫應(yīng)激[33]都會影響這些酶的合成或改變酶的活性,從而影響植物中酚類化合物的合成。地參結(jié)合酚的變化證實了采收期對多酚合成與代謝的影響,與郭琦等[34]的研究結(jié)果一致。

表1 地參結(jié)合酚提取物的酚含量(μg GAE/mg)Table 1 Total phenolic of bound phenolic from Lycopus lucidus Turcz.(μg GAE/mg)

2.2 地參結(jié)合酚提取物主要酚類化合物組成的分析

前期的研究結(jié)果顯示,地參結(jié)合酚提取物中主要的酚類化合物為咖啡酸和迷迭香酸[35],因此選取了咖啡酸和迷迭香酸為指標(biāo)成分。標(biāo)準(zhǔn)品及代表性地參結(jié)合酚提取物HPLC色譜圖見圖1。地參結(jié)合酚提取物中，咖啡酸和迷迭香酸的含量見表2。由表2可知,不同采收地和采收期的地參結(jié)合酚提取物中，咖啡酸和迷迭香酸的含量具有顯著性差異。隨著采收期的延后,S1采收的地參,其咖啡酸含量先下降了13.34%,再升高了13.63%,相反S2采收的地參,其咖啡酸含量先升高了77.48%,再下降了35.65%;在整個采收過程中,在S1采收的地參中迷迭香酸的含量下降了52.38%,而S2采收的地參中迷迭香酸的含量T3與T2相比,下降了7.08%?？Х人嵩谥参矬w內(nèi)通過一般的苯丙酸類途徑合成,PAL是影響其合成的關(guān)鍵酶。迷迭香酸在植物體內(nèi)的合成,首先是L-苯丙氨酸和L-酪氨酸分別在PAL、C4H、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)和TAT的催化下,轉(zhuǎn)化為4-香豆素基-輔酶A和4-羥基苯基丙酮酸;羥基苯基丙酮酸還原酶將4-羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化為4-羥基苯基乳酸;4-香豆素基-輔酶A和4-羥基苯基乳酸在迷迭香酸合成酶作用下,形成酯鍵連接起來,同時釋放輔酶A和生成4-香豆素基-4′-羥基苯基乳酸;4-香豆素基-4′-羥基苯基乳酸在細(xì)胞色素P 450依賴的單加氧酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槊缘闼?。由此可?迷迭香酸在植物體內(nèi)的合成與多種酶有關(guān)[36]。實驗結(jié)果顯示,同一采收地不同采收期地參的咖啡酸和迷迭香酸含量變化可歸因于不同的酚類化合物具有不同的合成代謝途徑。

表2 地參結(jié)合酚提取物中主要酚類化合物的含量(μg/mg EDW)Table 2 Content of main pehnolic compounds in bound phenolic from Lycopus lucidus Turcz.(μg/mg EDW)

圖1 酚酸標(biāo)準(zhǔn)品和代表性的地參結(jié)合酚提取物HPLC色譜圖(320 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of standards and representative bound phenolic from Lycopus lucidus Turcz.(320 nm)注:A:混合標(biāo)準(zhǔn)品;B:S1采收地T1采收期的地參結(jié)合酚提取物;峰1:咖啡酸;峰2:迷迭香酸。

2.3 地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見表3。地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨質(zhì)量濃度的升高而增強,呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.9。地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制能力用IC50值表示(抑制率達(dá)到50%時所需提取物濃度),IC50值越小,表明其抑制能力越強。隨著采收期的延后,S1采收的地參對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值先減小后增大,也即抑制作用先增強后減弱,T2采收期的抑制能力最強;S2采收的地參對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值先增大后減小,也即抑制作用先減弱再增強,且T1采收期的抑制作用最強。S1采收的地參對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值范圍為2.0275～3.2581 mg/mL,S2采收的地參對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值范圍為2.9535～3.7538 mg/mL,可以看出S1采收的地參對α-葡萄糖苷酶抑制作用強于S2采收地,這與提取物中的酚含量和酚類化合物單體組成不同有關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,提取物中酚含量、咖啡酸和迷迭香酸的含量與其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用沒有相關(guān)性(r=-0.291,p=0.575;r=-0.009,p=0.986;r=0.114,p=0.830),表明非酚類成分或其他酚類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也具有一定貢獻(xiàn)。Kwon等[37]研究了不同種類茶葉和葡萄酒對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其與酚類含量的關(guān)系,證實了其α-葡萄糖苷酶抑制活性與所含有的酚類物質(zhì)有關(guān)。有研究報道,原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、香豆酸、綠原酸等酚類物質(zhì)都具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性[37-38]。

表3 地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Table 3 The inhibitory effect of bound phenol from Lycopus lucidus Turcz. on α-glucosidase

2.4 地參結(jié)合酚提取物對胰脂肪酶的抑制作用

地參結(jié)合酚提取物對胰脂肪酶的抑制作用見表4。地參結(jié)合酚提取物對胰脂肪酶的抑制作用隨質(zhì)量濃度的升高而增強,呈良好的對數(shù)曲線關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.9。地參結(jié)合酚提取物對胰脂肪酶的抑制能力也用IC50值表示。隨著采收期的延后,S1采收的地參對胰脂肪酶抑制作用的IC50值先減小后增大,也即抑制作用先增強后減弱;S2采收的地參對胰脂肪酶抑制作用的IC50值先增大后減小,也即抑制作用先減弱后增強。S1采收的地參對胰脂肪酶抑制作用的IC50值范圍為1.4438～2.2076 mg/mL,S2采收的地參對胰脂肪酶抑制作用的IC50值范圍為1.5791～3.1030 mg/mL,可以看出S1采收的地參對胰脂肪酶抑制作用強于S2采收地。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,酚含量、咖啡酸和迷迭香酸的含量與其對胰脂肪酶的抑制作用沒有相關(guān)性(r=-0.222,p=0.673;r=-0.441,p=0.382;r=0.319,p=0.538),表明地參結(jié)合酚可能通過其主要成分或其各成分之間的協(xié)同作用,發(fā)揮其對胰脂肪酶的抑制作用。Bustanji等[39]在迷迭香中提取分離到迷迭香酸、沒食子酸、咖啡酸和綠原酸,對其進(jìn)行酶抑制實驗,發(fā)現(xiàn)均能抑制胰脂肪酶的活性。Mcdougall等[40]研究發(fā)現(xiàn),黃莓中的多酚能抑制胰脂肪酶活性。在本研究中,S1采收的地參結(jié)合酚單體含量較S2采收地的高,因此其對胰脂肪酶抑制作用強于S2采收地。

3 結(jié)論

以采自云南省劍川縣沙溪鎮(zhèn)兩個不同采收地三個不同采收期地參樣品為原料,對其酚含量及主要酚類化合物的組成進(jìn)行了分析,并測定了其對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制作用。結(jié)果表明,地參結(jié)合酚提取物酚含量范圍為155.55～164.95 μg GAE/mg,在整個采收期過程中,隨采收期的延后呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢;地參結(jié)合酚提取物主要酚類化合物為咖啡酸(40.67～72.18 μg/mg EDW)和迷迭香酸(22.01～46.22 μg/mg EDW);地參結(jié)合酚提取物對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制作用的IC50值范圍分別為2.0275～3.7538 mg/mL和1.4438～3.1030 mg/mL,研究結(jié)果為地參的開發(fā)與利用提供重要的理論依據(jù)。