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(1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.哈爾濱學院食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150080; 3.哈爾濱學院食品生物技術重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150080; 4.哈爾濱工業(yè)大學環(huán)境學院,黑龍江哈爾濱 150090)

中國是農業(yè)生產大國,在農業(yè)生產中產生玉米等農作物的秸稈,由于秸稈降解速度慢、深加工附加值低等原因,造成秸稈相對過剩[1-3]。

我國黑龍江綏化地區(qū)是糧食作物的主要產區(qū),但由于氣溫偏低,秸稈的微生物降解效率不高,焚燒的現(xiàn)象更為突出[4-5],成為秋冬季霧霾污染的主要原因之一,且存在安全隱患,因此,加強秸稈深度處理迫在眉睫[6-7]。

近年來,經過不斷地研究開發(fā),形成了以秸稈為原料的肥料化、燃料化、飼料化、原料化、基料化等途徑,其中以物理化學處理方法為主,但處理產生的廢棄物存在二次污染、成本昂貴且附加值低等問題[8-9]。利用微生物發(fā)酵分泌酶類來降解纖維素，具有條件溫和、能耗低、無二次污染等特點,成為關注的焦點。目前,能夠降解纖維素的微生物有很多,然而大多數(shù)研究都集中在常溫、高溫纖維素酶方面[10-11],關于低溫纖維素酶的研究相對較少,所以對秸稈進行自然狀態(tài)下低溫高效降解細菌群落的研究,可以為我國黑龍江綏化地區(qū)秸稈處理方面提供有益的理論基礎。

本研究采用MiSeq PE300多樣性測序的方法對秸稈上細菌群落進行深入分析,可得到豐富準確的物種分類信息,具有數(shù)據(jù)準確、速度快、通量高等特點,并結合生信分析和16S rDNA基因預測等技術,對2015～2017年秋季秸稈樣品進行采集和測序分析,獲取秸稈上具有分泌纖維素酶功能的主要細菌群落的多樣性和豐度信息,獲得位于黑龍江綏化地區(qū)低溫降解秸稈的主要細菌群落特征,為進一步生產低溫降解秸稈的微生物菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米秸稈 于2017年秋季采集黑龍江省明水縣田間的玉米秸稈,將2015、2016、2017年玉米秸稈標記為A、B、C樣品,采集完畢后將玉米秸稈用無菌剪刀、鑷子剪成1～2 cm并用無菌袋封好,運回實驗室后放入-80 ℃超低溫冰箱中凍存,備用,樣本信息詳見表1；Bacterial Genomic DNA Extraction Kit 美國Biovision公司;QuickClean II PCR抽提試劑盒 南京金斯瑞生物科技有限公司;TransStart FastPfu DNA Polymerase 北京全式金微生物技術有限公司;TruSeqTMDNA Sample Prep Kit 美國Illumina公司。

表1 樣品采樣地點信息表Table 1 Sample sampling location information sheet

SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;BX-6便攜式電熱恒溫培養(yǎng)箱 長春樂鏷科技有限公司;HS-IE數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱 上海和盛儀器科技有限公司;Scan300全自動菌落計數(shù)儀 法國Interscience公司;DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;JJ224BC分析天平 常熟市雙杰測試儀器廠;DW-86W100超低溫冰箱 上海摩速科學器材有限公司;DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠;GeneAmp9700 PCR儀 美國應用生物系統(tǒng)(ABI)公司;Miseq PE300二代高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組提取 無菌狀態(tài)下用鑷子、剪刀、研缽對1～2 cm的秸稈樣品進行預處理,稱取A、B、C破碎樣品各0.5 g,分別加入49.5 mL滅菌的生理鹽水中,振蕩混勻,吸取1 mL置入EP管中,3000 r/min離心20 s,吸取上清液,置入EP管,12000 r/min離心10 min,收集沉淀菌體,加入1 mL PE buffer混勻,按照Bacterial Genomic DNA Extraction Kit 基因組提取試劑盒說明提取三個樣本基因組,平行3次,置于-80 ℃的超低溫冰箱中儲存待用。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳 將提取獲得樣品基因組進行1%瓊脂糖凝膠電泳[12],條件為:電壓5 V、30 min。

1.2.3 16S rDNA的PCR擴增 擴增秸稈基因組的16S rDNA片段,采用引物338F(5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′)-806R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)擴增微生物基因組中16S rDNA的V4+V5區(qū)。PCR擴增條件為94 ℃反應4 min;94 ℃、45 s,55 ℃、45 s,72 ℃、60 s循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min;4 ℃終止反應[13-14]。擴增產物長度預計436 bp。

1.2.4 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳 擴增完成后,采用2%瓊脂糖凝膠進行鑒定,檢測各樣品16S rDNA擴增產物。

1.2.5 Illumina MiSeq高通量測序 委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司 MiSeq建庫,并進行生物多樣性測序,測序后對DNA序列拼接和質控,并以此為基礎進行生物信息學分析。

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1.2.6 纖維素降解細菌菌株的篩選 在15 ℃溫度下對玉米秸稈中低溫降解纖維素菌株進行篩選,以玉米秸稈粉為唯一碳源進行富集,稀釋涂布后反復分離純化得到單菌落,用1 mg/mL剛果紅染色液染色1 h,再用1 mol/L氯化鈉溶液洗脫30 min,通過觀察是否產生透明水解圈,初步判定所篩菌株對玉米秸稈的降解情況。玉米秸稈培養(yǎng)基、透明圈測定培養(yǎng)基等主要參照青格爾、姜立春等人的研究[15-16]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用R語言和mothur(https://mothur.org/wiki/Main_Page)軟件進行分析作圖,測序獲得基因序列與Silva(Release128 http://www.arb-silva.de)、EggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups,http://eggnog. embl.de/)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因組百科全書,http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫進行比對。

2 結果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定

由圖1所示,B樣本和C樣本上微生物基因組電泳條帶清晰,基因組提取效果良好,樣本A上基因組電泳條帶不清晰,需待PCR擴增后再次檢測,以確認是否可用于后期實驗。

圖1 秸稈基因組瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Straw genome agarose gel electrophoresis

由圖2瓊脂糖凝膠電泳結果可知,PCR擴增產物電泳條帶位于400～500 bp之間,長度與預測一致,亮度適中,DNA含量較高,可繼續(xù)進行實驗。

圖2 秸稈細菌群落16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of amplified products of 16S rDNA PCR from straw bacterial community

2.2 測序數(shù)據(jù)初步分析

2.2.1 測序結果 對2015～2017年玉米秸稈中細菌群落進行測序,共獲得61564385個堿基(base,bp),被聚類為582個OTU,共拼接成141219個16S rDNA基因片段,平均長度為430.06 bp。

2.2.2α-多樣性分析 對測序結果進行α-多樣性分析，以確定測序的質量,初步比較各樣本細菌群落的多樣性情況,見表2。

表2 樣本Alpha多樣性指數(shù)表Table 2 Alpha-diversity values of samples

由表2可見,C樣本的OTU值、Ace值和Chao值遠高于A樣本和B樣本;表明C樣本中細菌群落豐富度較高;B和C樣本的Simpson值高于A樣本且接近,說明二者之間細菌群落的多樣性相似,需進一步對比分析;各樣本的Shannon值和Coverage值相差不大,說明三個樣本之間具有相對獨立性,且Coverage值較高表明此次測序覆蓋率高,滿足樣本細菌多樣性分析的需要,可進一步分析[17]。

圖3 秸稈細菌群落Shannon曲線Fig.3 Shannon curve of straw bacterial community

2.3 細菌群落組成分析

2.3.1 秸稈細菌群落組成 根據(jù)測序結果和Sliva數(shù)據(jù)庫的比對結果，其中,Siwa數(shù)據(jù)庫比對列14門、29綱、70目、136科、282屬。對各樣本細菌群落在屬水平繪制累積圖,見圖4。

圖4 秸稈細菌群落屬水平組成分析Fig.4 Commposition analysis of the Genus level of the Straw bacterial community

研究發(fā)現(xiàn),A樣本物種豐度更加均勻,多樣性更加突出,B樣本次之。A樣本中優(yōu)勢菌屬主要為Rhizobium、Microbacterium、Sphingomonas、Devosia、Flavobacterium等;B樣本主要為Pseudomonas、Streptomyces、Promicromonospora、Rhizobium等;C樣本主要為Pseudomonas、Rahnella等。其中Pseudomonas、Devosia、Flavobacterium、Microbacterium、Streptomyces和Rhizobium等在秸稈中為主要優(yōu)勢菌屬,且能夠分泌纖維素酶,可作為低溫降解秸稈的優(yōu)先篩選菌。在后期研究中應重視分泌纖維素酶的優(yōu)勢菌群在不同溫度、不同儲存期間和不同營養(yǎng)狀態(tài)的生存情況。

2.3.2 細菌群落Heatmap圖 根據(jù)樣本間豐度的相似性在屬水平上進行聚類,對樣本中豐度前30的細菌進行分析,得出細菌群落Heatmap圖。通過顏色變化與相似程度來反映不同秸稈群落微生物在屬水平上群落組成的相似性和差異性。

圖5 秸稈細菌群落屬水平Heatmap圖Fig.5 Heatmap of the genus level of the straw bacterial community

Heatmap圖清晰表現(xiàn)了各樣本細菌群落的多樣性和豐度,A樣本和B樣本多樣性構成更加近似,在兩樣本中豐度高的屬細菌主要為Pseudomonas、Streptomyces、Brachybacterium、Rhizobium、Devosia、Microbacterium和Flavobacterium等。豐度前30的細菌隨著時間的推移產生一定的規(guī)律性,如:Sphingobium、Pseudomonas、Rahnella、Unclassfied_f_Micrococcaceae、Sphingomonas、Rahnella、Pedobacter等在時間延續(xù)的過程中,這些細菌對新鮮秸稈的降解能力較強,但隨著時間的延長,豐度逐漸降低,生存能力下降,對秸稈纖維素的降解能力可能也會逐漸降低;Pseudoclavibacter、Stenotrophomonas、Altererythrobacter、Curtobacterium、Devosia、Brevundimonas、unclassified_o_Micrococcales、Rhizobium、Lysinimonas、Microbacterium隨著時間的推移逐漸增加,豐度逐漸增加、活性逐漸增大,可能具有長期分泌纖維素酶來降解纖維素的能力。其中Pseudomonas、Rhizobium、Devosia、Microbacterium、Streptomyces、Flavobacterium等菌屬一直存在且能分泌纖維素酶,是要研究的主要菌落,與累積圖相符合。

2.4 細菌群落主成分分析

應用R語言進行PCA分析(Principal Component Analysis,主成分分析),分析OTU(97%相似水平)組成反應三年內秸稈的差異和細菌多樣性,樣本多樣性組成越相似,在PCA分析圖中的距離越接近。圖6為秸稈細菌群落在OTU水平上的主成分分析圖,PC1軸和PC2軸對樣本組成差異的貢獻值分別為69.28%和30.73%。通過分析發(fā)現(xiàn),A、B、C樣本間的距離均較大,細菌組成差異明顯。圖中A樣本距離溫度(T)、水分活度(Aw)遠,說明T和Aw對新鮮秸稈內細菌群落多樣性影響不大;B樣本和C樣本分別距離T和Aw向量的投影距離較小,即受影響相對較大,Aw越高,秸稈內細菌群落微生物生長越迅速,代謝活動也會隨著溫度的上升而增加,即隨著儲存時間的延長,秸稈內部的細菌多樣性會隨著T和Aw的變化而變化。

圖6 秸稈細菌群落主成分分析Fig.6 Principal component analysis of the Straw bacterial community

2.5 樣本中基因組COG功能分析

將測序獲得的reads進行16S rDNA功能預測,比對EggNOG數(shù)據(jù)庫,得到的COG功能分類統(tǒng)計圖見圖7。其中,橫坐標為不同年份玉米秸稈,縱坐標為各樣本中每個功能的豐度占該樣品所有功能豐度的比值。

圖7 秸稈細菌屬水平上COG功能分類統(tǒng)計圖Fig.7 Sample bacterial genera level COG function classification chart

從圖中可以看出,與物種組成相比,樣本A～C的COG功能組成相似,但豐度有所不同。Unigenes共有26個功能組,而在實驗所采集的玉米秸稈樣本中包含了22個功能組,從整體上看,B樣本內微生物代謝功能更為豐富,其次為A樣本。其中,B樣本在能量產生與轉化(C)、碳水化合物轉運與代謝(G)、核糖體構成和生物合成(K)、次生代謝產物的生物合成/運輸/分解代謝等功能上的豐度較高,可能與玉米秸稈分解代謝關系較緊密。

2.6 樣本中基因組KEGG豐度統(tǒng)計與通路分析

通過測序獲得的基因組與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對[18],得到KEGG樣品豐度統(tǒng)計表,如表3所示。

對不同年份玉米秸稈中基因組進行KEGG通路分析共獲得241條代謝通路,表3中列出了7種與玉米秸稈在降解過程中主要分解代謝有關的代謝途徑,其中ko00500代謝通路為秸稈中細菌菌群產生纖維素酶的主要通路。在ko00500代謝通路中,A樣本中微生物的淀粉和蔗糖代謝功能明顯高于B樣本和C樣本,說明隨著儲存時間的延長,秸稈中能夠分泌纖維素酶的細菌菌群豐度逐漸增大,淀粉和蔗糖代謝能力逐漸增強。從整體上看A樣本和B樣本在玉米秸稈降解過程中的代謝通路功能較接近且高于C樣本,與群落組成分析得到的結果一致。

2.7 降解纖維素功能的驗證

研究從秸稈中篩選2.2.1中豐度較高且能代謝纖維素酶的兩株細菌，在15 ℃溫度下進行分離純化,圖8為Pseudomonas和Streptomyces分泌纖維素酶產生的水解透明圈。說明這兩株細菌在低溫下具有較強分泌纖維素酶的功能,與測序及預測結果一致,在后期的研究中,將主要對高豐度的細菌進行進一步的研究。

圖8 秸稈細菌菌株剛果紅培養(yǎng)基水解效果Fig.8 Hydrolytic effect of Congo red medium with bacterial strain of straw

3 結論

通過對玉米秸稈中細菌群落進行Illumina Miseq PE300多樣性測序結果得知,2015年和2016年玉米秸稈細菌多樣性高于2017年玉米秸稈,并得到以下結論:通過對樣本內微生物群落結構與群落間的相似性、差異性比較分析,發(fā)現(xiàn)2015年玉米秸稈與2016年玉米秸稈細菌多樣性及豐度較為接近;將測序得到的結果進行16S rDNA功能預測,通過COG、KEGG功能分析可知,2015年和2016年玉米秸稈中的微生物代謝功能較2017年玉米秸稈豐富;由分析結果可預測降解玉米秸稈的菌屬主要有假單胞細菌屬(Pseudomonas)、德沃西亞菌屬(Devosia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和根瘤菌屬(Rhizobium)。綜上,通過高通量測序技術可以全面掌握玉米秸稈內微生物的多樣性和豐度變化,以及玉米秸稈降解過程中的代謝情況,為東北玉米秸稈生物資源化利用、尋找低溫降解菌奠定一定的理論基礎。