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(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南省高校重點實驗室培育基地, 新鄉(xiāng)市農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,河南新鄉(xiāng) 453003)

蘋果多酚是蘋果中多元酚類化合物的總稱,具有多種生理功能[1-3],在人類健康方面具有預(yù)防癌癥、預(yù)防高血壓、預(yù)防冠心病、抗菌消炎等作用[4-7]。蘋果中的多酚種類、含量與蘋果品種、成熟期、生態(tài)環(huán)境等因素密切相關(guān)[8-9],研究表明不同成熟期金冠(Golden Delicious)蘋果中綠原酸含量變化明顯,在蘋果生長中期綠原酸含量最高,到成熟期綠原酸含量降至50%[10];在釀酒蘋果皮中黃烷三醇類多酚含量較低,在果肉中含量較高[11]。蘋果多酚電位低,分子內(nèi)部含有大量的酚羥基,而酚羥基能夠提供大量活性很強的氫質(zhì)子,從而將活潑的單線態(tài)氧還原成穩(wěn)定的三線態(tài)氧,減少氧自由基的產(chǎn)生[12];蘋果多酚在有氧化酶的體系中可以抑制氧化酶的活性,間接的清除各種自由基[13],所以蘋果多酚作為一種高抗氧化活性物質(zhì)能夠應(yīng)用于食品工業(yè)[14],比如防止食品變質(zhì),減少維生素氧化等。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果 于2017年采摘于河南省鄭州市中國農(nóng)科院鄭州果樹所實驗基地,采摘的樣品置于4 ℃冷藏,一周內(nèi)完成分析。供試的蘋果來源如表1所示;原兒茶酸、兒茶素、花青素B2、表兒茶素、鞣花酸、槲皮素和根皮苷 購自Sigma-Aldrich;沒食子酸、綠原酸、金絲桃苷、咖啡酸 購于成都曼斯特有限公司;乙酸 分析級,購自科密歐化學(xué)試劑公司;甲醇 色譜級,購自Tedia;DPPH自由基醇溶液、Tris-HCl 緩沖液(pH8.2)、磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)、乙醇、Folin-Ciocalteu試劑 購自北京索萊寶公司;碳酸鈉、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鄰苯三酚、HCl、H2O2、FeSO4、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3等 均為分析純，購自西隴化工公司。

表1 13種蘋果來源Table 1 Source of thirteen varieties apples

QBS-80型汽爆工藝試驗臺 河南鶴壁正道重型機械廠;FW-400A高速萬能粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;SIGMA3-30K離心機 德國SIGMA公司;RP1000910059可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;ALPHA 2-4真空冷凍干燥室 德國CHRIST公司;7DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;XJ220A型分析天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;KH-100V型超聲波提取儀 昆山禾創(chuàng)(上海)儀器有限公司;R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Waters高效液相色譜,含1525二元泵,2998雙通道紫外檢測器,2707自動進樣器,Breeze色譜管理軟件等 美國Waters公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果的預(yù)處理 取100 g蘋果皮(約1 mm)在熱風(fēng)干燥箱中干燥,溫度45 ℃,時間2 h,得到蘋果渣并置于封口袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蘋果多酚的提取 取干燥后的蘋果渣在蒸汽壓力0.6 MPa爆破120 s,在500 mL三角瓶中加入10 g爆破處理得到的蘋果渣、200 mL 70%的乙醇和0.1 g抗壞血酸,攪拌均勻后置于80 Hz超聲波(100 W,40 ℃)條件下萃取15 min,然后將萃取液置于砂芯過慮得到第一次提取液,收集濾渣加入100 mL 70%的乙醇重復(fù)上述操作,合并提取液,在50 ℃條件下旋蒸濃縮至30 mL,即得到蘋果多酚提取液[25]。

1.2.3 蘋果多酚濃度測定 采用優(yōu)化的福林酚法[25]測定蘋果多酚含量。準確稱量1 mg沒食子酸溶于10 mL 70%乙醇作為母液。取9支100 mL的容量瓶,分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL上述標準液,添加5 mL Folin-Ciocalteu試劑,50 mL蒸餾水,搖勻后加15 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3溶液,用蒸餾水定容至刻度,并于室溫避光反應(yīng)2 h后,在765 nm下測定吸光度,以吸光度為縱坐標,沒食子酸濃度為橫坐標繪制標準曲線,并進行線性回歸分析。標準曲線的回歸方程為:y=0.1208x+0.0021,R2=0.9980。式中,y為吸光度,x為沒食子酸的濃度,μg/mL。將多酚提取液代替沒食子酸溶液按照上述方法測定吸光度,根據(jù)標準曲線計算蘋果多酚濃度。

1.2.4 蘋果多酚種類及單體酚含量的測定 取30 mL 1.2.2步驟得到的多酚提取液，旋蒸濃縮,用甲醇定容至10 mL。采用前期建立的HPLC方法[26]進行多酚種類的測定,Waters 2695系統(tǒng),C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)反相色譜柱,流動相分別是1%(V/V)乙酸水溶液(A)和色譜甲醇(B),梯度洗脫程序:0～10 min,5%～30% B;10～25 min,30%～50% B;25～35 min,50%～70% B;35～40 min,70%～5% B。柱溫常溫,流速1.0 mL/min,上樣量20 μL,檢測波長280 nm和320 nm。利用前期建立的各標品標準曲線計算單體酚的含量[26]。

1.2.5 抗氧化能力的測定

1.2.5.1 DPPH·的清除效果測定 采用Musa[27]的方法:將2 mL 0.2 mmol/L的DPPH·醇溶液加入到2 mL 1.2.2得到的多酚提取液中。用力振搖混勻后置暗室中靜置30 min,于517 nm測定吸光度值。以不加樣品作為空白對照。按式(1)計算DPPH·清除率。將單體酚溶液(濃度1 mg/mL)取代多酚提取液按照上述方法測定DPPH·清除率。

式(1)

式中,A0-空白對照液的吸光度,Ax0-樣品溶液本底的吸光度,Ax-樣品溶液的吸光度。

式(2)

式中,A0-空白對照液的吸光度,Ax0-樣品溶液本底的吸光度,Ax-樣品溶液的吸光度。

式(3)

式中,A0-空白對照液吸光度,Ax0-樣品溶液本底的吸光度,Ax-樣品溶液的吸光度。

1.2.5.4 ·OH清除效果測定 采用Rajauria[30]的方法:在1 mL 1.2.2得到的多酚提取液中加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L),最后加1 mL H2O2(8.8 mmol/L)在37 ℃反應(yīng)30 min,在510 nm下測定吸光度。以相同體積蒸餾水代替樣品作為空白對照組。以1 mL樣品溶液中、1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)和1 mL 蒸餾水混合液的吸光值作為樣品的本底吸收值。按下式計算·OH清除率。將單體酚溶液(濃度1 mg/mL)取代多酚提取液按照上述方法測定·OH清除率。

式(4)

式中:A0-空白對照液的吸光度;Ax-樣品溶液的吸光度;Ax0-樣品溶液本底的吸光度。

1.2.5.5 總還原能力測定 總還原能力測定采用Ozyurt[31]方法進行:l mL蒸餾水中加入0.2 mL 1.2.2得到的多酚提取液、2.5 mL磷酸緩沖液混合(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀,置于50 ℃反應(yīng)20 min,再加1 mL 10%三氯乙酸,離心10 min(3000 r/min),取上清液2.5 mL加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3,在700 nm 處測定吸光度。吸光度越高,說明樣品還原性越強。將單體酚溶液(濃度1 mg/mL)取代多酚提取液按照上述方法測定總還原能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)測定三次,用平均值±標準差表示,用SPSS(18.0)軟件進行數(shù)據(jù)分析,采用tukey法進行顯著性檢驗(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種蘋果多酚含量

按照1.2.2所述方法,采用爆破處理蘋果渣,超聲波輔助溶劑提取蘋果渣多酚。根據(jù)1.2.3建立的標準曲線計算蘋果多酚提取液的含量,結(jié)果如表2所示。不同品種蘋果中多酚含量有顯著差異(p<0.05)。新疆高酸品種紅勛一號多酚含量最高,達到5.35 mg/g,紅蓋露中多酚含量最低(2.05 mg/g),顏色較深的紅勛一號、蜜脆、澳洲青蘋、茂汶、富士、新疆二號等蘋果多酚含量較高,顏色較淺的爵士、紅蓋露、皮諾娃等蘋果多酚含量較低。說明多酚含量與蘋果品種有一定的關(guān)系,這與已有研究結(jié)果類似[9]。

表2 13種蘋果多酚含量Table 2 Polyphenols content of thirteen varieties apples

2.2 不同品種蘋果多酚種類及含量

將13種蘋果多酚提取液進行HPLC分析[25],測定結(jié)果如表3所示。

在檢測的13種蘋果中,紅勛一號是總多酚含量最高的品種,與其他單體酚相比,紅勛一號中金絲桃苷、花青素B2和鞣花酸是10種單體酚中含量較高的單體酚,而咖啡酸和槲皮素是10種單體酚中較低的單體酚,與其他品種蘋果相比,紅勛一號中金絲桃苷和花青素B2的含量是13個蘋果品種中最高的單體酚,而槲皮素和根皮苷是13個蘋果品種中較低的單體酚;紅蓋露是總多酚含量最低的品種,與其他單體酚相比,紅蓋露中金絲桃苷、鞣花酸和表兒茶素是10種單體酚中含量較高的單體酚,而咖啡酸和原兒茶酸是10種單體酚中含量較低的單體酚,與其他品種蘋果相比,紅蓋露中表兒茶素和金絲桃苷是13個蘋果品種中較高的單體酚,而原兒茶酸和根皮苷是13個蘋果品種中較低的單體酚;綜合比較發(fā)現(xiàn)在13種蘋果中鞣花酸、綠原酸、表兒茶素的含量相對較高,兒茶素、咖啡酸、原兒茶酸的含量相對較低,單體酚測定結(jié)果Urska等[9]的研究結(jié)果接近。不同品種蘋果單體酚的含量相差較大,有顯著性差異(p<0.05)。同一品種單體酚總量與總酚含量也有差異,是因為建立的HPLC方法檢測出了大部分含量較高的單體酚,個別含量低的單體酚沒有檢測出來。為了進一步研究各單體酚和總酚抗氧化活性之間關(guān)系,需要對各單體酚進行抗氧化活性測定。

2.3 不同品種蘋果多酚提取液體外抗氧化活性

圖1 13種蘋果總酚抗氧化能力Fig.1 Total polyphenols antioxidation activity of thirteen varieties apples注:1.皮諾娃;2.長富二號;3.爵士;4.茂汶;5.涼香;6. 凱蜜歐;7. 富士一系;8. 新疆二號;9. 紅蓋露;10. 玉華早富;11.澳洲青蘋;12.紅勛一號;13.蜜脆。

2.4 不同單體酚抗氧化活性

13種蘋果均檢測到10種單體酚,將各單體酚標品配制成含量為1 mg/mL的溶液,按照1.2.5方法對10種單體酚分別進行體外抗氧化活性測定,結(jié)果如圖2所示。

圖2 10種單體酚抗氧化能力Fig.2 Antioxidation activity of ten free phenols注:1.原兒茶酸;2.兒茶素;3.表兒茶素;4.根皮苷;5.綠原酸;6. 咖啡酸;7. 鞣花酸;8. 原花青素B2;9. 金絲桃苷;10. 槲皮素。

3 結(jié)論

利用蒸汽爆破聯(lián)合超聲波輔助萃取蘋果多酚并綜合評價了13種蘋果總多酚體外抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)13種蘋果多酚提取液均有抗氧化活性,但是有一定差異,通過比較說明不同品種蘋果多酚抗氧化活性與多酚含量沒有明顯的相關(guān)性;通過單體酚的檢測發(fā)現(xiàn)鞣花酸、表兒茶素和綠原酸含量較高的皮諾娃、長富二號、凱蜜歐、紅蓋露和玉華早富5種蘋果多酚提取液綜合抗氧化能力較強,從而證明不同品種蘋果多酚抗氧化能力與單體酚含量有相關(guān)性。通過上述結(jié)論對不同品種蘋果多酚抗氧化活性進行綜合分析揭示了單體酚和總酚抗氧化活性之間的關(guān)系,為進一步研究蘋果多酚功能活性提供研究基礎(chǔ),對不同蘋果多酚的應(yīng)用具有指導(dǎo)作用。