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(1.賀州學(xué)院,廣西賀州 542899; 2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院,福建泉州 362400; 3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建福州 350002; 4.閩臺(tái)特色作物病蟲(chóng)害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心,福建福州 350002; 5.福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002)

光照對(duì)花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的影響已有大量研究[3-6]。研究表明,光照是影響月季花變色的重要環(huán)境因子,遮光阻礙了花青素的合成,降低了CHS基因的表達(dá),導(dǎo)致花冠不能正常著色[7]。山川紫甘薯葉片的CHI基因受到光信號(hào)的誘導(dǎo),光的強(qiáng)度越大,基因的表達(dá)量越高[8]。在強(qiáng)光誘導(dǎo)下,擬南芥中的F3H基因表達(dá)量上調(diào);弱光下,該基因表達(dá)量下調(diào)[9]。目前,光照對(duì)紫葉茶樹(shù)葉色表型的機(jī)理尚不清晰。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)紫葉茶樹(shù)進(jìn)行遮陰處理,誘導(dǎo)葉色變異;測(cè)定不同處理下各樣本中的葉綠素相對(duì)含量、茶多酚、兒茶素組分、黃酮總量及組分、總花青素苷的含量,分析其對(duì)葉色表型及生化成分的影響。這一問(wèn)題的解答對(duì)解析光照調(diào)控紫葉茶樹(shù)葉色表型及理化成分的含量有著理論價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料為武夷奇種C18 由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供;花青素(純度>97%)、山奈酚(純度 97.7%)、楊梅素(純度95%)、槲皮素(純度 95%)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)ChromaDex公司;表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin,EGC,純度>99%)、表兒茶素(epicatechin,EC,純度>99%)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG,純度>99%)、兒茶素(catechin,C,純度>99%)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechin gallate,ECG,純度>99%)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG,純度>99%)、咖啡堿(純度>99%)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;福林酚、磷酸、甲醇、碳酸鈉、茚三酮、三氯化鋁、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(分析純)、甲醇、乙腈(色譜純) 國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

FA1004型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;722S型可見(jiàn)分光光度機(jī) 北京瑞利分析儀器有限公司;e2695型高效液相色譜儀、2998型PDA檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司;植物粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;TDL-40B離心機(jī) 北京亞力恩科學(xué)器材公司;DHG-9123A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;NF333型色差儀 Nippon Denshoku Industries Co. Ltd.,Japan。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 遮陰處理 試驗(yàn)在福建省武夷山市茶葉研究所資源圃中完成。2015年4月中旬,挑選生長(zhǎng)發(fā)育良好、整齊一致、樹(shù)形基本相似的植株27株,分為3組(每9株為1組,每重復(fù)3株),掛牌標(biāo)記,并對(duì)其進(jìn)行同一高度的修剪。待茶樹(shù)芽頭萌動(dòng)之時(shí),開(kāi)始遮陰處理。根據(jù)前期研究結(jié)果設(shè)2個(gè)處理:分別用遮陰75%和60%的黑色遮陽(yáng)網(wǎng)遮光,以全光照處理為對(duì)照。經(jīng)過(guò)15 d的遮陰處理,取經(jīng)遮陰處理和全光照處理(CK)的武夷奇種C18葉片(第一葉位),參考GB/T 8303-2013 《茶 磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測(cè)定》,采用120 ℃烘干固樣,得到葉片粉末,分裝于不同的自封袋,并做好標(biāo)記。

1.2.2 葉色表型分析 用NF333型色差儀測(cè)定葉片CIEL*a*b*值,使用色差儀以光源C/2 °為條件測(cè)量葉片的顏色,取葉片正面,平置于干凈的白紙上,將集光口對(duì)準(zhǔn)葉片中部位置進(jìn)行測(cè)量,最終取5個(gè)測(cè)量的平均值,數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007分析。

1.2.3 葉綠素相對(duì)含量的測(cè)定 對(duì)“武夷奇種C18”進(jìn)行不同程度的遮陰處理,15 d后,用SPAD-502葉綠素儀測(cè)定鮮葉(第一葉位)葉綠素相對(duì)含量,分別在葉片的上、中、下部位測(cè)定,每個(gè)部位重復(fù)6次,結(jié)果取3個(gè)部位的平均值。

腦卒中是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的常見(jiàn)病之一，也是發(fā)病率、致殘率、致死率極高的危險(xiǎn)疾病，給病人及家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)[11]。家庭照顧者是腦卒中病人家庭康復(fù)照護(hù)主力，其優(yōu)質(zhì)的照護(hù)服務(wù)對(duì)腦卒中病人病情恢復(fù)和生活質(zhì)量提高具有重要作用。但長(zhǎng)時(shí)間的護(hù)理照顧會(huì)使照顧者產(chǎn)生巨大的精神壓力，誘發(fā)照顧者各種負(fù)性情緒。陳軍軍[2]研究發(fā)現(xiàn)：腦卒中家庭照顧者中35.9%有抑郁癥狀，53.2%有焦慮癥狀，較高的照顧者負(fù)性情緒不僅不利于照顧者身心健康，還可引發(fā)照顧者流失率增高、照顧質(zhì)量下降，甚至發(fā)生病人虐待現(xiàn)象。

1.2.4 花青素苷總量的測(cè)定

1.2.4.1 花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL的花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于6支10 mL具塞比色管中,各加入甲醇溶液至1.0 mL,然后加入6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液(體積比為95∶5)和0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫酸鐵銨溶液,搖勻后,置沸水浴中加熱40 min,然后迅速冷卻,在波長(zhǎng)400～680 nm處進(jìn)行掃描,確定其最大吸收波長(zhǎng)657 nm,于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.4.2 葉片粉末花青素含量的測(cè)定 先用無(wú)水乙醇和濃鹽酸配制0.1 mol·L-1的鹽酸乙醇溶液,然后分別取不同處理葉片粉末各1.000 g,放入回流裝置中,再加入20 mL的鹽酸乙醇溶液,在60 ℃的水浴鍋中浸提回流60 min?；亓鹘Y(jié)束后,將提取液倒入25 mL的容量瓶中,定容到25 mL。以0.1 mol·L-1的鹽酸乙醇溶液作為參比液,在分光光度計(jì)下測(cè)定提取液在530、657 nm的吸光值[10]。

1.2.4.3 花青素含量的計(jì)算 花青素含量(mg/g)=(OD530-0.25×OD657)/M

式中:OD530:花青素在530 nm波長(zhǎng)下的光密度;OD657:花青素在657 nm波長(zhǎng)下的光密度;M:取樣質(zhì)量。

1.2.5 葉片粉末茶多酚總量、兒茶素組分的測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)GB/T 8313-2008茶葉粉末中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法。

1.2.6 葉片粉末黃酮總量及黃酮苷元的測(cè)定 黃酮總量測(cè)定采用三氯化鋁比色法:稱(chēng)取1.2得到的茶葉粉末1.00 g于100 mL三角瓶中,加沸蒸餾水40 mL,置水浴鍋中浸提30 min,過(guò)濾到50 mL容量瓶,加水定容,搖勻?yàn)楣┰囈?。吸取供試?.5 mL,加1%三氯化鋁溶液至10 mL,搖勻10 min后移入1 mL比色皿,用水代替茶湯作為空白試驗(yàn),在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)其吸光度。

1.2.6.1 黃酮苷元的測(cè)定方法 參考李家華等[11]建立的液相色譜法。色譜柱:TSK gel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動(dòng)相:A相:0.2%磷酸水溶液;B相:100%甲醇。梯度從30%B到80% B,流速0.8 mL/min,55 min內(nèi)完成,檢出波長(zhǎng)360 nm,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量10 μL,每一次完成后系統(tǒng)平衡10 min后再次進(jìn)樣。每個(gè)樣品6次重復(fù)。

1.2.6.2 黃酮苷元標(biāo)準(zhǔn)液的制備 分別精密稱(chēng)取楊梅素、槲皮素和山柰酚對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。精密吸取3種對(duì)照品溶液1 mL置10 mL的容量瓶中,加甲醇至刻度,作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液溶液。分別取楊梅素、槲皮素和山柰酚對(duì)照品溶液用甲醇稀釋得到0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液。用封口膜密封后置冰箱中冷藏備用。

1.2.6.3 黃酮苷元供試品溶液的制備 用水浴加熱回流裝置制備供試品溶液。將1.2.1得到的茶葉粉末,精確稱(chēng)取粉末1.00 g,加甲醇40 mL,鹽酸4 mL,置于圓底燒瓶中回流水解1.5 h(85 ℃),過(guò)濾,濾液置50 mL容量瓶,用少許甲醇洗滌殘?jiān)叭萜?洗滌液并入容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾,即得。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)中各數(shù)據(jù)均為個(gè)獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同遮陰處理下紫葉茶樹(shù)葉片的表型特征

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的表型特征發(fā)生了變化(如表1)。用色差儀NF333 測(cè)定發(fā)現(xiàn),+a*到-a*的轉(zhuǎn)變意味著紅紫色減退,綠色增強(qiáng),-b*到+b*的變化代表了藍(lán)色逐漸消退,黃色增強(qiáng)。與CK相比，75%遮陰葉片的紅紫度減退,藍(lán)度降低,即呈更弱的著色(如圖1)。結(jié)果表明，光照越強(qiáng),葉片的呈色越紫。這是由于，強(qiáng)光促使花青素合成途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)上調(diào),從而使花青素的含量增加。

表1 不同遮陰處理下葉片的表型特征Table 1 Phenotypic characteristics of leaves under different shading treatments

圖1 不同遮陰處理下茶樹(shù)葉片(第一葉位)Fig.1 Tea leaves(first leaf position) under different shading treatments注:A:CK;B:60%遮陰;C:75%遮陰。

2.2 不同遮陰處理對(duì)紫葉茶樹(shù)葉片葉綠素相對(duì)含量的影響

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的葉綠素相對(duì)含量發(fā)生了變化(如圖2)。圖2的檢測(cè)結(jié)果表明,正常光照下,葉綠素相對(duì)含量較低,75%遮光下的葉綠素相對(duì)含量最高,不同遮陰處理下葉綠素相對(duì)含量差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)。

圖2 不同遮陰處理對(duì)葉片葉綠素相對(duì)含量的影響Fig.2 Effect of different shading treatments on the relative content of chlorophyll in leaves注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)；圖3、圖4、圖6同。

2.3 不同遮陰處理對(duì)紫葉茶樹(shù)葉片花青素苷總量的影響

為研究光照強(qiáng)弱對(duì)紫葉茶樹(shù)葉片呈色的影響,設(shè)置不同遮陰處理,檢測(cè)其花青素苷總含量(圖3)。結(jié)果表明,光照越強(qiáng),花青素苷總含量越高;光照越弱,花青素苷總含量越低。且不同遮陰處理下花青素苷總量差異達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。這一結(jié)果與觀測(cè)到的葉片表型特征一致。這是由于，強(qiáng)光促使花青素合成途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)上調(diào),從而使花青素的含量增加。弱光則抑制花青素合成途徑,結(jié)構(gòu)基因表達(dá)下調(diào),花青素含量降低。

圖3 不同遮陰處理對(duì)紫葉茶樹(shù)葉片花青素苷總含量的影響Fig.3 Impact on the total content of anthocyanin purple leaf tea leaves of different shading treatments注：不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2.4 不同遮陰處理對(duì)茶樹(shù)葉片茶多酚總量的影響

花青素苷是植物新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的類(lèi)黃酮物質(zhì),是類(lèi)黃酮途徑的一個(gè)分支途徑。兒茶素屬于黃烷醇類(lèi)化合物,是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的主體成分。這些物質(zhì)除了同屬于類(lèi)黃酮途徑,還是茶葉當(dāng)中的主要功能性成分，同時(shí)也能解析光照強(qiáng)弱對(duì)茶葉主要功能性成分含量的影響。

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的茶多酚含量發(fā)生了變化(圖4)。從圖4可看出,未經(jīng)過(guò)遮陰處理的CK組的茶多酚含量最高。與對(duì)照組相比,60%遮陰程度的處理組茶多酚含量減少了17.81%,75%遮陰處理組則減少了25.54%。且不同遮陰處理下茶多酚含量差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)。結(jié)果表明,光照較強(qiáng),茶多酚含量較高;隨著遮陰程度的加深,茶多酚含量減少。這與閻意輝等[12]研究遮陰處理對(duì)云抗10號(hào)茶樹(shù)新梢的影響結(jié)果是一致的。

圖4 不同遮陰處理對(duì)紫葉茶樹(shù)葉片茶多酚含量的影響Fig.4 Effect of tea polyphenols purple leaf blades of different shading treatments

2.5 不同遮陰處理對(duì)茶樹(shù)葉片兒茶素組分的影響

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的茶多酚含量發(fā)生了變化(如圖5和表2)。由圖5和表2可知,在兒茶素組分中,未遮陰的CK與60%遮陰的酯型兒茶素的總量都要高于非酯型兒茶素,而75%遮陰處理則是非酯型兒茶素總量要略高于酯型兒茶素。從整體來(lái)看,EGCG含量較高,其次是EGC、EC與ECG的含量。從TC(總兒茶素)含量可看出,遮陰程度最高的75%遮陰的TC含量最低,為7.6%;未遮陰的CK組含量則最高,為10.91%;數(shù)值為遮陰程度居中的60%遮陰含量也位于兩者之間,為8.65%。結(jié)果表明,光照較強(qiáng),總兒茶素含量較高;隨著遮陰程度的加深,總兒茶素含量減少。這是由于，弱光抑制兒茶素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),從而使總兒茶素含量減少。

表2 不同遮陰處理對(duì)紫葉茶樹(shù)兒茶素組分含量的影響(%)Table 2 Effect of different shading treatments on content of purple leaf tea catechin component(%)

圖5 不同遮陰處理下紫葉茶樹(shù)兒茶素組分圖Fig.5 Purple leaf tea catechin components of different shading treatments

2.6 不同遮陰處理對(duì)茶樹(shù)葉片黃酮總量及組分的影響

“武夷奇種C18”在不同遮陰處理下,葉片的黃酮總量發(fā)生了變化。從圖6可以看出,隨著遮陰程度的加深,武夷奇種C18幼嫩新梢中的黃酮總量也呈下降趨勢(shì)。且不同遮陰處理下黃酮總量差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)。與CK對(duì)照組相比,60%遮陰處理的減少了14.36%,75%遮陰處理的則減少了29.08%。結(jié)果表明:黃酮總量會(huì)隨著遮陰程度加深而減少。這是由于弱光抑制黃酮合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),從而使黃酮總量減少。

圖6 不同處理對(duì)紫葉茶樹(shù)黃酮苷總量的影響Fig.6 Different treatments on the total amount of purple leaf tea flavonoid glycosides

測(cè)定水解后不同處理下紫葉茶樹(shù)中含量較高的3種黃酮苷元楊梅素、槲皮素、山奈酚(圖7和表3),從圖7和表3可以發(fā)現(xiàn)未遮陰的CK組的楊梅素、山奈酚、槲皮素等組分含量居于三組之最,遮陰程度最深的75%遮陰組的各組分含量則是三組最低的。結(jié)果表明,黃酮組分含量會(huì)隨著遮陰程度加深而減少。這是由于，弱光抑制黃酮合成途徑中FHT結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),從而使楊梅素、山奈酚、槲皮素組分含量減少。

圖7 不同遮陰處理下紫葉茶樹(shù)黃酮組分圖Fig.7 Purple leaf tea flavonoid component diagram under different shading treatments

表3 不同遮陰處理對(duì)紫葉茶樹(shù)黃酮組分的影響(mg/g)Table 3 Effect of different shading treatments on purple leaf tea flavonoid component(mg/g)

3 討論與結(jié)論

花青素是決定茶樹(shù)葉片顏色的主要色素,屬于茶樹(shù)次生代謝產(chǎn)生的類(lèi)黃酮化合物[13]。目前已知茶葉中主要含有3種花青素[14-17],花青素在細(xì)胞中合成,但在液泡中積累,產(chǎn)生的顏色從紅到紫[18-20]。其中,矢車(chē)菊色素是紫紅色;飛燕草色素和錦葵色素是紫色。在茶樹(shù)葉片細(xì)胞中合成的花青素在液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GST等轉(zhuǎn)運(yùn)因子作用下運(yùn)輸?shù)揭号葜衃14]。最后在內(nèi)因和外因共同作用下,茶樹(shù)葉片呈現(xiàn)紫色或紅紫色。迄今為止,花青素苷合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因已從茶樹(shù)中分離獲得[21-28]。光照對(duì)茶樹(shù)花青素合成途徑相關(guān)基因的影響已有報(bào)道。對(duì)新梢白化茶樹(shù)品種“黃金芽”進(jìn)行遮陰處理,結(jié)果抑制了CHS3基因的表達(dá)[29]。但是對(duì)于光照這個(gè)重要環(huán)境因子影響紫葉茶樹(shù)葉色表型的機(jī)理尚不清晰。

本研究將紫葉茶樹(shù)進(jìn)行不同程度的遮陰處理,結(jié)果表明,伴隨著遮陰程度的加深,紫葉茶樹(shù)葉片中葉綠素相對(duì)含量呈逐漸上升的趨勢(shì),75%遮陰條件下葉綠素相對(duì)含量最高;而花青素苷含量呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),正常光照條件下(CK)總花青素苷含量最高。這與金魚(yú)草、矮牽牛和非洲菊[30-32]等植物中的研究結(jié)果相似。這說(shuō)明光照強(qiáng)弱和著色有著密切的關(guān)系,光照增強(qiáng),葉片呈深紫色,即葉片能夠正常著色;光照減弱,葉片呈淡紫色、綠色或呈白色,即葉片不能夠正常著色,這可能受到共同的上游途徑調(diào)控。隨著遮陰程度的加深,紫葉茶樹(shù)葉片中茶多酚、兒茶素組分、黃酮總量及組分都呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),正常光照條件下(CK)這些含量最高。這與閻意輝[12]等人的研究結(jié)果相似。

本研究解析了紫葉茶樹(shù)葉片在不同遮陰處理下主要生化成分的變化:光照越強(qiáng),茶多酚、兒茶素組分、黃酮總量、黃酮組分、總花青素苷的含量越高,反之,則越低。但要闡明光照調(diào)控紫葉茶樹(shù)葉片中花青素苷合成與呈色的機(jī)理,還需要進(jìn)行大量的工作。比如進(jìn)一步研究紫葉茶樹(shù)葉片中花青素苷合成途徑對(duì)光信號(hào)響應(yīng)的分子途徑;通過(guò)比較不同光照條件下基因表達(dá)模式和花青素苷含量的差異,找出關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基因;進(jìn)一步克隆相關(guān)基因的啟動(dòng)子片段,為深入解析光照誘導(dǎo)紫葉茶樹(shù)葉色變異的分子機(jī)理提供參考。