歐瑩，華芮，林妙玲，全松

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510515)

自1978年7月25日首例試管嬰兒在英國誕生后，輔助生殖技術(shù)(ART)為越來越多的不孕不育患者解決了生育問題，全世界已有超過540萬兒童在ART后出生[1]。然而其安全性仍存在爭議，其出生子代的出生缺陷問題引起越來越多人關(guān)注。先天性心臟缺陷(CHD)是最常見的出生缺陷，我國CHD的發(fā)生率高達14.2‰[2]，且呈逐年上升趨勢。有Meta分析研究表明ART子代CHD風(fēng)險高于自然受孕的子代[3]。但是缺少針對不同ART對CHD影響的系統(tǒng)Meta分析。本研究采用Meta分析的方法比較ICSI和IVF對子代CHD的影響，為進一步認(rèn)識ART的子代安全性和促進優(yōu)生優(yōu)育提供一定參考。

資料與方法

一、檢索策略

通過計算機檢索Cochrane Library、PubMed、Medline、EMbase等外文數(shù)據(jù)庫以及維普(VIP)、中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方等國內(nèi)數(shù)據(jù)庫，檢索時間從建庫至2017年12月，并通過人工閱讀檢索參考文獻以避免文獻漏檢。發(fā)表研究的語言限制為中文和英文。英文檢索式以PubMed為例：#1：MeSH“assisted reproductive technology”[Title/Abstract]；#2：MeSH“congenital malformations”[Title/Abstract]；#3：MeSH“cohort studies”，結(jié)果：#1 And #2 And #3。所有檢索采用主題詞[MEDLINE (MeSH)，EMbase (EMTREE)]與自由詞相結(jié)合的方式，所有檢索策略通過多次預(yù)檢索后確定。檢索對象限制為人類，文獻類型限于隊列研究(cohort studies)或病例對照(case-control studies)研究。

二、文獻納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入所有ART與子代CHD關(guān)系的隊列研究，語種限于中英文，未限人群。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)采用隊列研究設(shè)計；(2)暴露因素為接受IVF或ICSI治療；(3)研究對象為接受IVF或ICSI治療后出生的嬰兒；(4)觀察終點為出生時所有類型CHD。

文獻排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)同人群重復(fù)研究；(2)CHD患者接受ART治療的研究；(3)ART與其他出生缺陷的相關(guān)研究；(4)重要資料報告不全且聯(lián)系作者未回復(fù)者。

三、研究質(zhì)量評價

采用Newcastle-Ottawa scale (NOS)量表[4]對入選文獻進行評分，評價內(nèi)容包括：(1)暴露隊列的代表性：①能夠很真實地代表社區(qū)人群的平均或基本可以代表社區(qū)人群的平均 (1分)；②選取特殊人群或沒有說明隊列的來源(0分)。(2)非暴露隊列的選擇：①來自暴露隊列的同一社區(qū)(1分)；②與暴露隊列的來源不同或沒有說明非暴露隊列的來源(0分)。(3)暴露的確定：①可靠的記錄或結(jié)構(gòu)化調(diào)查(1分)；②書面的自我報告或無描述(0分)。(4)研究開始前沒有研究對象發(fā)生結(jié)局事件(1分)。(5)可比性：①研究控制了最重要的因素(1分)；②控制了其他重要的混雜因素(1分)。(6)結(jié)局事件的評估：①獨立的、盲法的評估或鑒定或聯(lián)動數(shù)據(jù)(1分)；②自我報告或無描述(0分)。(7)為觀察到結(jié)局發(fā)生，隨訪充分(1分)。(8)隨訪的完整性：全部隨訪或少數(shù)失訪或?qū)κгL進行了描述(1分)。

四、資料提取

由3位研究者按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)獨立篩選文獻，采用事先設(shè)計的資料提取表提取信息，包括研究項目時間、地點，納入者的一般特征，接受ART類型，結(jié)局類型與隨訪時間，并逐一交叉核對。如存在分歧，則通過討論解決；如研究報告的資料不全，則進一步與該研究作者聯(lián)系獲取，若最終未獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，則剔除該項研究。

五、數(shù)據(jù)分析

采用Cochrane協(xié)作網(wǎng)提供的RevMan5.3統(tǒng)計軟件對13篇最終納入研究的文獻進行Meta 分析，并根據(jù)周期類型及CHD類型進行亞組分析。首先采用Cochrane Q檢驗及I2檢驗對研究間異質(zhì)性進行檢驗，若P≥0.1說明研究間同質(zhì)性較好，反之則具有異質(zhì)性；根據(jù)I2值進一步按照25%、50%、75%將異質(zhì)性劃分為低、中、高3個等級[5]。若研究間同質(zhì)性較好，則采用固定效應(yīng)模型進行合并，反之則選擇隨機效應(yīng)模型，并對其異質(zhì)性來源進行分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)可能出現(xiàn)的異質(zhì)性因素進行亞組分析，并采用敏感性分析來分析檢驗結(jié)果的穩(wěn)定性。同時采用漏斗圖判斷發(fā)表偏倚。

結(jié) 果

一、文獻檢索結(jié)果

初檢相關(guān)文獻1 039篇，其中英文942篇，中文97篇。經(jīng)過剔除重復(fù)文獻并閱讀文題和摘要后剔除明顯不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的805篇，然后通過閱讀全文，進一步排除不符合納入標(biāo)準(zhǔn)及無法提取數(shù)據(jù)的研究217篇，最終納入13篇隊列研究[6-18]進行Meta分析，出生兒共63 147例。其中5篇[7，10，13，17-18]對CHD種類進行了細分。文獻篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

二、納入研究的基本特征

納入研究包括13篇研究不同ART與CHD關(guān)系的英文文獻[6-18]，其中5篇[7，10，13，17-18]對CHD種類進行了細分，包括室間隔缺損(VSD)、房間隔缺損(ASD)、動脈導(dǎo)管未閉(PDA)和法洛(Fallot)四聯(lián)征(TOF)。納入的13篇研究均為隊列研究，其中6篇為前瞻性隊列研究，7篇為回顧性隊列研究。各研究特征見表1。

短語結(jié)構(gòu)的句法分析一直是英語的句法分析的主要工作，而依存句法的研究開展則相對滯后。Melchuk在1988年全面系統(tǒng)的研究了英語的依存語法理論，Eisner[1]在1997年最先提出了樹庫轉(zhuǎn)化的思想，依存樹庫通過短語樹庫轉(zhuǎn)化得到，并進行了相關(guān)的轉(zhuǎn)化實驗。Eisner在數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換時對含連詞的句子進行過濾，其余的句子使用規(guī)則進行自動轉(zhuǎn)換，得到了90.1%的依存正確率。

表1 納入文獻的基本特征

①：室間隔缺損(VSD)；②：房間隔缺損(ASD)；③：動脈導(dǎo)管未閉(PDA)；④：法洛四聯(lián)征(TOF)

ET：新鮮胚胎移植；FET：凍融胚胎移植

三、納入研究的方法學(xué)質(zhì)量評價

由3位研究員獨立進行文獻檢索并提取資料。篩選研究的方法學(xué)質(zhì)量評價采用 Newcastle-Ottawa scale(NOS)量表[4]進行評估，具體包括研究人群選擇、可比性、結(jié)果評價3個部分共8個條目。采用星級系統(tǒng)的半量化原則，滿分為9顆星(9分)，13篇研究質(zhì)量評分≥8分，均為高質(zhì)量隊列研究。混雜因素設(shè)定為女方年齡、病因、不孕年限、多胎妊娠等[19-21]。各研究質(zhì)量評價結(jié)果見表2。

四、Meta分析結(jié)果

1.IVF和ICSI對子代CHD發(fā)生率的影響：對13項隊列研究[6-18]中的子代出生CHD進行Meta分析，經(jīng)異質(zhì)性檢驗I=19%(<25%)且P=0.26(>0.1)，提示納入的13篇隊列研究無異質(zhì)性且有較好的同質(zhì)性，應(yīng)采用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果如圖2，OR=1.09[95%CI(0.93，1.27)]且Z=1.04(P=0.30)，提示IVF和ICSI兩種授精方式對后代CHD發(fā)生率的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表2 納入文獻的質(zhì)量評價結(jié)果

圖2 兩種授精方式對子代CHD發(fā)生率的影響

2.不同移植周期對子代CHD發(fā)生的影響：對其中3項研究[7， 15-16]的新鮮周期下IVF和ICSI對CHD風(fēng)險的影響隊列研究進行異質(zhì)性檢驗I=0%且P=0.99(>0.1)，表明納入的3項研究無異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果如圖3，OR=2.07[95%CI(1.28，3.37)]且Z=2.94(P=0.003)，提示新鮮周期時ICSI組比IVF組子代有更高的CHD發(fā)生率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。凍融周期方面，因為僅1項隊列研究[7]明確凍融周期來源，因此未進行分析。

3.IVF和ICSI對子代PDA發(fā)生的影響：對3篇涉及CHD中PDA類型的研究[10， 17-18]進行合并異質(zhì)性檢驗I=0%且P>0.1，提示無異質(zhì)性，用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果如圖4所示，OR=1.07[95%CI(0.57，2.04)且Z=0.22(P=0.83)，提示ICSI組與IVF組子代PDA患病率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由于無新鮮周期，因此不對新鮮周期亞組進行分析。

4.IVF和ICSI對子代ASD發(fā)生的影響：有4篇涉及ICSI和IVF對子代ASD發(fā)生影響的隊列研究[7，10，17-18]，對其進行異質(zhì)性檢驗I=6%且P=0.36(>0.1)表明無異質(zhì)性，所以應(yīng)用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果如圖5示，OR=0.97[95%CI(0.47，2.02)]且Z=0.08(P=0.93)，兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明ICSI組與IVF組比較，并沒有增加子代ASD發(fā)生風(fēng)險。因僅1項研究[7]是新鮮周期移植，因此不做新鮮周期亞組分析。

圖3 新鮮周期下CHD發(fā)生率比較

圖4 PDA發(fā)生率比較

圖5 ASD發(fā)生率比較

5.IVF和ICSI對子代VSD發(fā)生的影響：有5篇研究涉及ICSI和IVF對子代VSD發(fā)生影響的隊列研究[7，10，13，17-18]，合并進行異質(zhì)性檢驗I=0%且P=0.62(>0.1)表示無異質(zhì)性，使用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果見圖6，OR=1.02[95%CI(0.53，1.96)]且Z=0.06(P=0.95)，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，提示ICSI組與IVF組比較，并沒有增加VSD發(fā)生風(fēng)險。由于僅1項研究[7]是新鮮周期移植，未做新鮮周期亞組分析。

6.IVF和ICSI對子代TOF發(fā)生的影響：有3篇涉及ICSI與IVF對子代TOF發(fā)生影響的隊列研究[7，10，18]，合并進行異質(zhì)性檢驗I=13%且P=0.32(>0.1)表示無異質(zhì)性，使用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果見圖7，OR=1.07[95%CI(0.28，4.15)且Z=0.10(P=0.92)，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，提示ICSI與IVF相比，并不增加子代TOF發(fā)生風(fēng)險。僅一項研究[7]是新鮮周期移植，未做新鮮周期亞組分析。

圖6 VSD發(fā)生率比較

圖7 TOF發(fā)生率比較

五、發(fā)表偏倚分析

采用RevMan5.2軟件繪制13項研究的漏斗圖。圖形顯示，左右對稱且呈倒漏斗形，提示不存在發(fā)表偏倚(圖8)。

圖8 以CHD發(fā)生率為基準(zhǔn)的發(fā)表偏倚分析漏斗圖

討 論

本Meta分析納入了13項關(guān)于不同ART對CHD發(fā)生風(fēng)險的隊列研究[6-18]，其中有5篇[7，10，13，17-18]涉及CHD不同種類的隊列研究，出生兒共63 147例。Meta分析提示ICSI和IVF兩種不同授精方對CHD發(fā)生的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。由于FET對新生兒畸形率的影響目前存在爭議[22-23]。我們對新鮮周期的隊列研究進行了進一步的亞組分析，發(fā)現(xiàn)新鮮周期中ICSI組比IVF組子代CHD發(fā)生風(fēng)險顯著提高(P<0.05)。這與Maheshwari等[24]的研究相似，胚胎冷凍復(fù)蘇可能會降低ART引起的子代出生缺陷風(fēng)險。這可能是冷凍復(fù)蘇的過程本身就是對胚胎優(yōu)勝劣汰的選擇，可以篩選出好的胚胎移植[25]。雖然形態(tài)好的胚胎會優(yōu)先新鮮周期移植，但剩余的能耐受凍存的質(zhì)量好的胚胎亦具有良好的發(fā)育潛能和著床能力，而質(zhì)量差的胚胎則在冷凍復(fù)蘇過程中更易受到損害，影響后續(xù)著床，不能成功妊娠。

ICSI增加CHD風(fēng)險可能與受精方式本身相關(guān)。與IVF相比，ICSI繞過了卵母細胞對精子自然選擇的屏障，可能會注入質(zhì)量差的精子，將某種基因缺陷和高遺傳風(fēng)險的基因傳給下一代[26-27]。并且ICSI對于卵母細胞是一種有創(chuàng)性操作，因此操作過程中可能存在對卵母細胞結(jié)構(gòu)的機械性損傷和胞漿內(nèi)環(huán)境的變化，干擾紡錘體或細胞的正常周期[28]。并且精子在ICSI過程中經(jīng)過的各種檢測手段也可能導(dǎo)致傷害。多項研究發(fā)現(xiàn)ICSI后胚胎染色體異常、甲基化異常[29-30]和mRNA介導(dǎo)的基因表達異常[27]增多。ICSI治療后的男性后代出現(xiàn)Y染色體缺失及染色體核型異常發(fā)生率相對較高[26]，包括22q11.2缺失，18號染色體異常等。

但也研究認(rèn)為ICSI與IVF這兩種授精方式本身對胚胎發(fā)育潛能的影響無顯著差異，配子的質(zhì)量才是決定胚胎發(fā)育潛能，進而影響妊娠結(jié)局的重要因素[31]。與IVF的指征(包括女方因素和男方少弱精子癥)比較，ICSI主要適用于男性因素不育。無精子癥患者伴有較高的染色體微缺失[32]。男性不育患者的精子中也逐漸發(fā)現(xiàn)多種非編碼RNA的表達調(diào)控異常[33]。其后代伴有較高的染色體異常率[34]和印跡基因甲基化水平異常[30]。

而染色體改變和基因異常等遺傳因素是CHD的危險因素。22q11.2微缺失被認(rèn)為與嚴(yán)重主動脈肺動脈側(cè)支動脈、PDA、肺動脈閉鎖和VSD等主要CHD發(fā)病有關(guān)[35]。GATA4等基因的突變、拷貝數(shù)變異、多態(tài)性和甲基化常都可引起心臟畸形[36-38]，其中心臟特異轉(zhuǎn)錄因子基因TBX5、GATA4等異?？蓪?dǎo)致如ASD、VSD、PDA、TOF、心內(nèi)膜墊缺損及右心室發(fā)育不良等許多遺傳性和單發(fā)CHD[37]。多種miRNAs、cirRNAs和lncRNAs的表達調(diào)控異常也逐漸被發(fā)現(xiàn)與CHD相關(guān)[39-40]。ICSI有創(chuàng)的受精方式和配子較高的低質(zhì)量率所帶來的胚胎染色體及基因異常率增加，可能與ICSI組子代較高的CHD發(fā)生率有關(guān)。

但是通過對4種常見CHD的亞組進行分析，我們發(fā)現(xiàn)ICSI組子代PDA、ASD、VSD及TOF的患病率并沒有顯著高于IVF組。由于對新鮮周期下不同CHD的研究較少，因此我們沒有對新鮮周期進行亞組分析。在沒有排除胚胎冷凍因素的影響下，我們不能肯定ICSI是否不會增加子代4種常見CHD風(fēng)險，尚有待進一步研究。

目前對ICSI技術(shù)導(dǎo)致后代出生缺陷的遺傳突變的發(fā)生規(guī)律仍然知之甚少，故植入前遺傳學(xué)檢測十分重要。胚胎植入前非整倍體篩查(PGS)可在胚胎移植前對胚胎染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)量進行檢測和篩查，從而避免染色體相關(guān)的先天缺陷。有研究顯示ICSI后行PGS可明顯改善妊娠結(jié)局[41]。植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)可通過微陣列技術(shù)(aCGH)和高通量測序等技術(shù)對單基因多態(tài)性和突變進行分析，對每條染色體的非整倍性進行評估，以選擇正常的胚胎移植，不僅可以避免染色體相關(guān)的先天缺陷，還可以避免心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子突變和單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致的單發(fā)型CHD[42]。另外，還有必要對精子進行相關(guān)基因篩查，提高精子質(zhì)量，進而降低后代CHD發(fā)生的風(fēng)險。

但本研究尚存在一些不足之處：(1)本研究所包含的各隊列研究中，存在兩種類型隊列研究，前瞻性的證據(jù)等級高于回顧性隊列研究，本次Meta分析由于文獻數(shù)量有限并未對此進行亞組分析，這在很大程度上影響了循證醫(yī)學(xué)結(jié)論的強度。(2)本次Meta分析所納入的資料均為公開發(fā)表，并可在全文中獲得完整數(shù)據(jù)的文獻，共計13篇，可能存在文獻收錄不全的問題。(3)Meta分析本身是一種觀察性研究而不是實驗研究，因此質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)因主觀因素不可能完全一致，這也是Meta分析固有的局限性。因此有待進一步開展調(diào)整匹配死產(chǎn)流產(chǎn)率、不孕不育病因、胚胎形態(tài)等因素的大樣本、多中心、長時間隨訪的ART對子代CHD影響的前瞻性隊列研究。