伍娜娜，康 超，榮 娜，劉 祥*，陳春琳，陳 琛，丁 銳，吳三橋

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001； 2.陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中723001)

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是隸屬于弧菌科弧菌屬的嗜鹽嗜溫性革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海洋、河口、海水養(yǎng)殖池等水體環(huán)境中[1]，可引起水產(chǎn)貝、蝦、蟹、魚類等敗血癥和胃腸炎[2-6]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。同時(shí)該菌是一種人畜共患致病菌，可污染人類的食物，引起腹瀉、創(chuàng)傷感染、中耳炎等多種疾病[8-10]，嚴(yán)重危害人類健康?？股厥欠乐稳茉寤【腥镜闹饕瘜W(xué)藥物[11]，但長期使用抗生素，難免出現(xiàn)藥物殘留、細(xì)菌耐藥性提高等問題。因此，迫切需要研發(fā)一種新型疫苗來防治溶藻弧菌疾病。

溶藻弧菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB是一種周質(zhì)蛋白[12]，與外膜脂蛋白Pal相互作用以介導(dǎo)內(nèi)外層之間的接觸，可促進(jìn)運(yùn)輸并保持膜完整性，其運(yùn)動(dòng)依賴于生物聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。龐歡瑛等[8]用溶藻弧菌TolB蛋白免疫石斑魚發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌TolB蛋白可激活石斑魚體內(nèi)的特異免疫反應(yīng)，且對石斑魚的免疫保護(hù)率達(dá)76%，表明溶藻弧菌TolB蛋白有較好的免疫保護(hù)功能，能有效抵抗溶藻弧菌對機(jī)體的感染，是一種很好的候選疫苗蛋白。

為進(jìn)一步提高溶藻弧菌TolB蛋白的免疫功能，借助生物信息學(xué)軟件，為溶藻弧菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，預(yù)測和分析其基本理化性質(zhì)、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)與卷曲螺旋、三級結(jié)構(gòu)以及優(yōu)勢的B、T細(xì)胞抗原表位，設(shè)計(jì)重組表位多肽疫苗，為溶藻弧菌TolB蛋白疫苗的研制，尤其是多表位串聯(lián)疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的溶藻弧菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB序列(登錄號：WP_005387925.1)，共含450個(gè)氨基酸，序列如下：MIRRLLLGMFVLFSSMTNVANAALELVITDGIDSARPIAVVPFKWEGTQALPTDVSAVIASDL-QRSGKFSPVPTSKMPQTPFSESEVNFDAWTNLGVDA-LLTGSIKQNDQGDYVINYQLVDIVRGQLTGGKSKAL-GSDGELVLSKDHVLFNKVATVQGPRMREYAHRISD-LVYEQLTGDRGAFMTRIAYVVVNDKDRFPYQLRVA-DYDGYNERLVLRSKQPLMSPAWSPDGKKLAYVSFQ-NGQAEIFIMNIYTGEREKITSYPRHNGAPRFSPDGNK-LAIVLSKTGSLHVYTFDLNTRKLTQITRGRSNNTEPF-WHPDGKSLIFTSDRGGKPQIYQVNLGSGSIDRLTWQ-GSQNLGGQITPDGRFLVMVNRSNAGFNLAKQDLET-GALQVLTKTLLDESPSIAPNGGMVVYSSIYNKKNVL-SMVSIDGRFKARLPATNGRVRAPAWSPFL。

1.2 方法

1.2.1 進(jìn)化關(guān)系分析 利用DNAMAN 8.0軟件，將NCBI數(shù)據(jù)庫公布的不同菌株TolB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 理化性質(zhì)分析 采用ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)網(wǎng)絡(luò)在線軟件對溶藻弧菌TolB蛋白相對分子質(zhì)量、親水性、等電點(diǎn)、脂肪指數(shù)、穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測分析；采用ProtScale analysis方法預(yù)測親水性圖譜。

1.2.3 信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)與高級結(jié)構(gòu)分析 采用Signal P 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)軟件對溶藻弧菌TolB蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測；利用TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)隱馬爾科夫模型對其跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用SOPMA、SWISS-MODEL在線預(yù)測軟件，分別對溶藻弧菌TolB蛋白進(jìn)行二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 通過String蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測網(wǎng)站(http://www.string-db.org/)，預(yù)測溶藻弧菌TolB蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 細(xì)胞抗原表位分析 綜合BepiPred 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)方法和ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)方法預(yù)測溶藻弧菌TolB蛋白的B細(xì)胞表位，獲得其優(yōu)勢肽段。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位采用在線軟件nHLAPred(http://www.imtech.res.in/raghava/nhlapred/comp.html)，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法進(jìn)行預(yù)測； 通過ProPred在線軟件預(yù)測輔助T細(xì)胞(Th)抗原表位。

1.2.6 串聯(lián)表位重組預(yù)測 為了篩選抗原性較好的組合作為多表位疫苗的最佳氨基酸序列，首先將獲得的優(yōu)勢抗原表位按照B細(xì)胞、CTL及Th抗原表位順序依次編號，其次在相鄰表位間添加4個(gè)甘氨酸(GGGG)進(jìn)行柔性分割，再利用DNASTAR 7.1軟件對獲得的B、T表位肽段進(jìn)行不同排列組合優(yōu)化，再將其翻譯為核酸序列，從而獲得最終的重組表位多肽及核苷酸序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻弧菌TolB蛋白氨基酸序列的同源性與系統(tǒng)發(fā)生分析

采取生物信息學(xué)軟件DNAMAN 8.0對不同菌株的TolB蛋白氨基酸序列同源性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，TolB蛋白在不同種類的細(xì)菌中序列一致性較強(qiáng)， TolB蛋白的功能在這些細(xì)菌中具有相似性(圖1)。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，同一菌屬在進(jìn)化分支上位置較近，其中溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和費(fèi)氏弧菌進(jìn)化距離更近(圖2)。這4種菌的TolB蛋白序列具有較高同源性，推測TolB蛋白免疫動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗體，可能對這4種菌的感染存在交叉免疫保護(hù)作用。

圖1 TolB蛋白氨基酸序列同源性分析

圖2 TolB蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

2.2 溶藻弧菌TolB蛋白理化性質(zhì)分析

通過ExPASy-ProtParam在線預(yù)測軟件對溶藻弧菌TolB蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測，結(jié)果顯示，其相對分子質(zhì)量為49737.67，等電點(diǎn)為9.49，脂肪指數(shù)(Aliphatic index)為86.20；不穩(wěn)定指數(shù)(II)為33.71，表明溶藻弧菌ToIB蛋白屬于穩(wěn)定蛋白；平均親水性(GRAVY)為-0.273，表明溶藻弧菌TolB蛋白為親水性蛋白(圖3)。

圖3 溶藻弧菌TolB蛋白疏水性分析

2.3 溶藻弧菌TolB蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)分析

采用Signal P 4.1軟件對溶藻弧菌TolB蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示，溶藻弧菌TolB蛋白的信號肽序列由N端的22個(gè)氨基酸殘基組成(1—22位)，切割位點(diǎn)在第22—23個(gè)氨基酸殘基(圖4)。應(yīng)用TMHMM Serverv 2.0軟件對溶藻弧菌TolB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，TolB蛋白沒有跨膜區(qū)，所有區(qū)域均在細(xì)胞膜外，是一種外膜蛋白(圖5)。

2.4 溶藻弧菌TolB蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SOPMA在線預(yù)測軟件對溶藻弧菌TolB蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，可信度為82.00%，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占比分別為18.67%、11.33%和40.00%(圖6)?？梢?，溶藻弧菌TolB蛋白無規(guī)則卷曲含量較高，該部位可能存在抗原表位。通過SWISS-MODEL在線預(yù)測軟件模擬溶藻弧菌TolB蛋白三維空間結(jié)構(gòu)(圖7A)，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌TolB蛋白主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，其次是β-轉(zhuǎn)角，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果具有一致性。溶藻弧菌TolB蛋白三維空間結(jié)構(gòu)模型覆蓋率為100%，可靠性較高(圖7B)。

圖4 溶藻弧菌TolB蛋白信號肽預(yù)測

圖5 溶藻弧菌TolB蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

c:無規(guī)則卷曲; e:β-片層; h:α-螺旋; t:β-轉(zhuǎn)角圖6 溶藻弧菌TolB蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 溶藻弧菌TolB蛋白作用網(wǎng)絡(luò)分析

對溶藻弧菌TolB蛋白進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，溶藻弧菌TolB與10種蛋白質(zhì)存在相互作用，其中pal蛋白、lky蛋白、tolQ蛋白、ybgF蛋白與TolB蛋白作用更為緊密(圖8)。

2.6 溶藻弧菌TolB蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

綜合ABCpred方法和BepiPred 2.0方法預(yù)測溶藻弧菌TolB蛋白B細(xì)胞抗原表位，獲得細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位為64—79、171—181、254—264、428—435位(表1—2)。

圖7 溶藻弧菌TolB蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖8 溶藻弧菌TolB蛋白相互作用蛋白質(zhì)預(yù)測

2.7 溶藻弧菌TolB蛋白T細(xì)胞抗原表位分析

2.7.1 溶藻弧菌TolB蛋白CTL抗原表位預(yù)測 CTL表位預(yù)測采用nHLAPred軟件，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法，選用HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203，HLA-A*0205五種分子結(jié)合肽(表3)，獲得TolB的CTL抗原表位為148—156位的VLFNKVATV。

表1 ABCpred 方法預(yù)測溶藻弧菌TolB蛋白B細(xì)胞抗原表位的肽段位置

表2 BepiPred 2.0方法預(yù)測溶藻弧菌TolB蛋白B細(xì)胞抗原表位的肽段位置

表3 溶藻弧菌TolB蛋白CTL抗原表位預(yù)測

續(xù)表3 溶藻弧菌TolB蛋白CTL抗原表位預(yù)測

2.7.2 溶藻弧菌TolB蛋白Th抗原表位預(yù)測 應(yīng)用在線軟件ProPred對溶藻弧菌TolB蛋白進(jìn)行Th抗原表位預(yù)測，選用DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301 三種不同多肽類型(表4)。綜合相同抗原表位序列分析得到，溶藻弧菌TolB蛋白的Th抗原表位是26—34位的LVITDGIDS。

表4 溶藻弧菌TolB蛋白Th抗原表位預(yù)測

2.8 溶藻弧菌TolB蛋白重組串聯(lián)抗原表位的設(shè)計(jì)

為得到抗原性較好的串聯(lián)表位序列，將獲得的B、T抗原表位進(jìn)行編號，在相鄰表位間添加4個(gè)甘氨酸(GGGG)作為柔性片段，再用DNASTAR 7.1，將B細(xì)胞表位設(shè)置為epitope1—epitope4，CTL表位設(shè)置為epitope5，Th表位設(shè)為epitope6，分析線性表位的各種排列方式，對不同的排列組合進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳順序?yàn)閑pitope1-epitope6-epitope3-epitope2-epitope5-epitope4(圖9)。轉(zhuǎn)化成氨基酸序列為：QRSGKFSPVPTSKMPQGGGGLVITDGIDSGGGGGEREKITSYP-RGGGGLVYEQLTGDRGGGGGVLFNKVATVGGGGG-RFKARLP(下劃線為柔性片段)。翻譯成核酸序列為CAACGTAGTGGTAAATTTAGCCCAGTTCCAACG-AGCAAAATGCCACAAGGTGGCGGTGGCGTGCTGTT-CAATAAAGTAGCCACTGTTGGTGGCGGTGGCGGTG-AACGTGAGAAAATTACTTCATACCCACGTGGTGGC-GGTGGCTTGGTGTATGAGCAGTTGACTGGCGACCG-TGGCGGTGGCGGTGGCTTGGTCATTACCGATGGTA-TTGATTCAGGTGGCGGTGGCGGTCGATTCAAAGCT-AGATTACCG(下劃線為柔性片段核酸序列)。

圖9 溶藻弧菌TolB蛋白重組表位多肽抗原指數(shù)分析

3 結(jié)論與討論

生物信息學(xué)分析是目前分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要手段[14-15]，可進(jìn)行蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)及高級結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確預(yù)測[16]，尤其在蛋白質(zhì)的抗原表位分析和設(shè)計(jì)方面，有降低試驗(yàn)盲目性，提高工作效率等特點(diǎn)，在疫苗研制上被應(yīng)用廣泛[17]。

溶藻弧菌TolB氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)生分析顯示，溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和費(fèi)氏弧菌親緣關(guān)系較近，表明溶藻弧菌TolB蛋白對這4種菌的感染可能存在交叉免疫保護(hù)作用，這為蛋白質(zhì)多肽疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。這4種菌形態(tài)上均為弧菌，可見本研究得到的分子學(xué)分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌TolB蛋白為親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，存在信號肽序列，表明溶藻弧菌TolB蛋白位于細(xì)胞膜外。因而，TolB蛋白與宿主免疫系統(tǒng)存在直接的相互作用，推測TolB蛋白易于激活宿主的免疫功能，從而具有較高的免疫原性[8]。溶藻弧菌TolB蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占40.00%，而此結(jié)構(gòu)易形成盤旋、扭曲，暴露在蛋白質(zhì)外層，成為優(yōu)勢細(xì)胞抗原表位的可能性較大[18]，為抗原表位的存在奠定基礎(chǔ)。

目前， B細(xì)胞表位的常用預(yù)測方法有BepiPred、ABCpred和DNASTAR[19]。BepiPred方法主要是利用隱馬爾可夫模型以及氨基酸的特定性質(zhì)進(jìn)行線性表位的預(yù)測[20]；基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的ABCpred方法，預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確率較高[21]。同時(shí)使用2種方法，可提高預(yù)測的準(zhǔn)確性[22]。本研究結(jié)合BepiPred 2.0與ABCpred方法對溶藻弧菌TolB蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測，并結(jié)合二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，選取抗原性較好的無規(guī)則卷曲位置作為B細(xì)胞表位序列，最終獲得溶藻弧菌TolB蛋白B細(xì)胞表位為64—79、171—181、254—264、428—435位。這為串聯(lián)表位疫苗的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。

CTL細(xì)胞表位是抗原中與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合后，經(jīng)過抗原呈遞作用，可激活CTL細(xì)胞免疫的短肽，常見預(yù)測CTL細(xì)胞表位的方法有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法、IEDB、SYFPEITHI、BIMAS、IMTECH、NetCTL和NetMHC等[18,23-26]，在腫瘤、病毒、細(xì)菌和寄生蟲CTL抗原表位預(yù)測上均有應(yīng)用[24,27]。本研究采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法對溶藻弧菌TolB蛋白的CTL表位分析，結(jié)果得到該蛋白CTL表位為148—156位的VLFNKVATV，這些溶藻弧菌TolB蛋白的肽段可能與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，經(jīng)過呈遞作用，最終活化CTL細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

Th細(xì)胞表位是抗原中與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合后，會(huì)增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)能力的短肽，表達(dá)于APC表面，而被CD4+T細(xì)胞識別結(jié)合，活化Th細(xì)胞以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體[28]。本試驗(yàn)通過選取3類不同等位基因的Th表位進(jìn)行分析，獲得溶藻弧菌TolB蛋白的Th表位區(qū)段為，26—34位的LVITDGIDS，這些Th表位序列可能與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合形成復(fù)合物，經(jīng)抗原呈遞后激活機(jī)體的免疫反應(yīng)。表位疫苗是一種可同時(shí)攜帶多個(gè)抗原表位及輔助性表位的疫苗，具有安全性好、易操作和可控等優(yōu)點(diǎn)[29]。劉昆梅等[30]設(shè)計(jì)的多表位疫苗，不僅結(jié)構(gòu)合理且有較強(qiáng)的反應(yīng)原性。預(yù)測溶藻弧菌TolB蛋白細(xì)胞表位，對研發(fā)TolB蛋白表位疫苗具有重要意義。

本研究對溶藻弧菌TolB蛋白的生物學(xué)分析，成功預(yù)測到其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征，并得到了抗原性較好的重組多肽。為TolB蛋白的深入研究以及疫苗和免疫診斷試劑的研制奠定了理論基礎(chǔ)。然而，該蛋白新合成的重組多肽免疫保護(hù)功能還有待于更深層次的研究和闡釋。