連凱琪，周玲玲，張明亮，王英杰，張 慢，宋玉偉

(安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院/河南省動物疫病防控與營養(yǎng)免疫院士工作站/河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實驗室，河南 安陽 455000)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circoviruses, PCV)是一種無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈的DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬[1]。2016年以前，在豬群中僅發(fā)現(xiàn)PCV-1和PCV-2兩個基因型。其中，PCV-1對豬無致病性，而PCV-2在豬場能引起呼吸、繁殖、消化等多系統(tǒng)癥狀，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[2-3]。2016年，美國學(xué)者從患病母豬及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)鑒定并命名了一種新發(fā)豬圓環(huán)病毒3型(PCV-3)[4]。此后，多個國家均報道了PCV-3的感染病例，我國科研人員也相繼檢測到PCV-3，已有至少13個省豬場存在PCV-3感染，且主要分布于中東部地區(qū)[5-6]。波蘭、韓國、泰國等也報道了豬群中存在PCV-3感染[7-8]。PCV-3的基因組長約2 000 bp，目前，只有2個開放閱讀框ORF1(Rep)和ORF2(Cap)被鑒定[5,9]。與PCV-2相似，Rep蛋白主要參與病毒復(fù)制，Cap蛋白為PCV-3唯一的病毒衣殼蛋白[10]。PCV-2的Cap蛋白基因工程亞單位疫苗已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，且Cap蛋白也被用于開發(fā)成抗體檢測試劑盒。因此，Cap蛋白成為PCV-3生產(chǎn)基因工程亞單位疫苗和診斷類試劑盒的首要候選抗原。

目前，關(guān)于PCV-3 Cap蛋白的研究還比較少，有學(xué)者使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PCV-3 Cap蛋白或部分Cap蛋白，但都沒有詳細(xì)的報道，且表達(dá)量不高。PCV-3 Cap蛋白原核表達(dá)后主要用于制備單克隆抗體或開發(fā)抗體診斷方法方面，尚未見利用Cap蛋白制備基因工程亞單位疫苗的報道[11-12]。本研究擬通過高效表達(dá)Cap蛋白，以期為進一步規(guī)?；磉_(dá)PCV-3 Cap蛋白、開發(fā)基因工程亞單位疫苗等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

質(zhì)粒pMD18-T-Cap、pET30a(+)載體、大腸桿菌DH5α菌種和BL21 ( DE3)菌種由河南省動物疫病防控與營養(yǎng)免疫院士工作站實驗室保存。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、Premix rTaq均購自大連寶生物工程有限公司；酵母抽提物、胰蛋白胨、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自Solarbio生物公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega Bio-tek公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；蛋白質(zhì)Marker(ml016140)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker(22617)購自Thermo pierce公司。

1.3 PCV-3 Cap136—645基因的克隆

根據(jù)測得的PCV-3(MH683051)全基因序列，設(shè)計引物并引入2個酶切位點和保護堿基，Cap136—645-F：CGCGGATCCATGAACGTCATATCCGTTG (下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點),Cap136—645-R：TCCCAAGCTTGAGAACGGACTTGTAAC(下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點)，該對引物擴增片段大小約為528 bp，引物由金維智生物科技有限公司合成。 PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中：Premix rTaq 25 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，質(zhì)粒pMD18-T-Cap模板2 μL，用滅菌蒸餾水補足50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共40個循環(huán); 72 ℃ 延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化。

1.4 重組質(zhì)粒pET30a(+)-Cap136—645的構(gòu)建

將純化的Cap136—645基因片段經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后回收，定向插入表達(dá)載體pET30a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落于37 ℃搖菌12～14 h，提取質(zhì)粒，將PCR和雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送至金維智生物科技有限公司測序。

1.5 重組Cap136—645蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET30a(+)-Cap136—645轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)，涂布含有卡那霉素的LB瓊脂平板，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落于37 ℃搖菌過夜，將菌液分別按1∶100比例接種含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h后，將每管菌液平均分成2管，一管加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，另一管不加IPTG作為對照，同時將pET30a(+)轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞作為陰性對照。將IPTG組和對照組菌液都放入37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，然后12 000 r/min離心1 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀，取80 μL加入20 μL 5×Loading Buffer沸水煮10 min制備樣品，進行SDS-PAGE分析。

1.6 重組Cap136—645蛋白的Western blot鑒定

將1.5中的誘導(dǎo)菌進行SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，使用1∶2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體孵育，對重組蛋白進行Western blot分析。

1.7 重組Cap136—645蛋白的可溶性表達(dá)分析

將1.5中過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100接種于100 mL含卡那霉素的培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，分別加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，置于25 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，然后12 000 r/min離心1 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀洗2次，加入10 mL PBS重懸沉淀后置于冰上進行超聲破碎，工作3 s，間歇3 s，共30 min，將破碎后的菌液12 000 r/min離心10 min，取上清液80 μL，用100 μL PBS重懸沉淀后也取80 μL，分別加入20 μL 5×Loading Buffer沸水煮10 min制備樣品，進行SDS-PAGE分析。

1.8 重組Cap136—645蛋白的純化

按照參考文獻(xiàn)[13-14]中的KCl染色切膠純化的方法，對包涵體表達(dá)的重組Cap136—645蛋白進行純化，然后通過SDS-PAGE對純化的重組蛋白進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV-3 Cap136—645基因的克隆結(jié)果

以質(zhì)粒pMD18-T-Cap為模板，通過PCR方法成功克隆到豫北PCV-3毒株(GenBank登錄號MH683051)的Cap136—645基因，長度為528 bp(圖1)。

M．DL2000 DNA Marker; 1.PCR擴增產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒pET30a(+)-Cap136—645的鑒定結(jié)果

將重組質(zhì)粒pET30a(+)-Cap136—645分別用PCR擴增和雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示，PCR擴增條帶單一，大小約528 bp，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切也出現(xiàn)1條大小約528 bp的條帶(圖2)。測序結(jié)果進一步證實，重組質(zhì)粒pET30a(+)-Cap136—645構(gòu)建成功。

M1.DL2000 DNA Marker; M2.DL15000 DNA Marker;

2.3 Cap136—645蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET30a(+)-Cap136—645轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在IPTG濃度為0.5 mmol /L的條件下誘導(dǎo)表達(dá)Cap136—645蛋白，收集菌液進行SDS-PAGE檢測，可見分子質(zhì)量約27.5 ku的特異性蛋白條帶，pET30a(+)空載體表達(dá)對照組沒有出現(xiàn)目的條帶(圖3)。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.pET30a(+)未誘導(dǎo)；2.pET30a(+)誘導(dǎo)；

2.4 重組Cap136—645蛋白的Western blot鑒定結(jié)果

Western blot結(jié)果表明，誘導(dǎo)菌在約27.5 ku的位置出現(xiàn)了明顯的條帶(圖4)，與SDS-PAGE電泳中特異性表達(dá)的條帶位置相符，表明成功表達(dá)了重組Cap136—645蛋白。

M.預(yù)染蛋白質(zhì)Marker; 1.pET30a(+)-Cap136—645的誘導(dǎo)菌液;

2.5 重組Cap136—645蛋白可溶性表達(dá)分析結(jié)果

重組質(zhì)粒pET30a(+)-Cap136—645轉(zhuǎn)化的E.coliBL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞在IPTG終濃度為1 mmol/L、25 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)6 h時，重組Cap136—645蛋白以包涵體形式大量表達(dá)(圖5)。

2.6 重組Cap136—645蛋白的純化結(jié)果

將切膠回收的產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，純化的蛋白質(zhì)在約27.5 ku的位置出現(xiàn)了條帶(圖6)。測定結(jié)果顯示，純化的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度高達(dá)1.28 μg/μL。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.菌體超聲破碎沉淀；2.菌體超聲破碎上清

M．蛋白質(zhì)Marker；1.蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物

3 結(jié)論與討論

目前，關(guān)于新發(fā)豬PCV-3的來源尚不清楚、典型的臨床癥狀尚不明確、分離和培養(yǎng)技術(shù)還未成熟、致病機制的相關(guān)研究更少，PCV-3的研究主要集中于流行病學(xué)、診斷方法等方面。PCV-3作為新發(fā)豬病毒病，急需安全可靠的疫苗進行免疫防控，以及診斷類生物制品進行病原診斷與抗體評價。鑒于Cap蛋白在PCV-3的疫苗開發(fā)和診斷類生物制品研發(fā)中所起的重要作用。本研究在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對部分PCV-3 Cap蛋白片段進行表達(dá)優(yōu)化，實現(xiàn)高效表達(dá)，制備純度較高的Cap蛋白。

PCV-3 Cap蛋白在N端含有核定位信號序列，很難實現(xiàn)整個基因的體外表達(dá)。本文首先克隆了PCV-3的部分Cap基因(136—645位)，并構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-Cap136—645。重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliBL21 (DE3)后進行了表達(dá)條件優(yōu)化，確定在1 mmol/L IPTG、25 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)6 h時，重組Cap136—645蛋白實現(xiàn)了高效體外表達(dá)。最后，鑒定該融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，并通過切膠進行了純化。Deng等[12]曾表達(dá)并純化了部分Cap蛋白片段。與其相比，本研究純化的目的蛋白純度較高，在后續(xù)的研究中降低了雜蛋白的影響。

本研究對重組PCV-3 Cap136-645蛋白進行了原核表達(dá)并純化，為后續(xù)開發(fā)PCV-3抗體診斷試劑盒、制備Cap的單抗或多抗、研發(fā)PCV-3基因工程亞單位疫苗等提供基礎(chǔ)和抗原材料。