劉 振，張 俠，尹海波，陳世華，郭善利

(煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005)

長期以來，對土地不合理的利用(不合理輪作、過度施用化肥、不合理澆灌、過度放牧等)及對植被資源的過度開采，導(dǎo)致土地受到不同程度的鹽漬化威脅，荒漠戈壁灘的面積也不斷擴大，同時，鹽漬化和干旱也成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要非生物脅迫因素。因此，如何有效地開發(fā)利用鹽堿地、干旱地成為社會關(guān)注的重點。

互花米草(Spartinaalterniflora)是一種禾本科米草屬的多年生草本植物，適宜生長在潮間帶，起源于美國大西洋沿岸和墨西哥灣，引進中國后主要分布在沿海灘涂地帶。互花米草葉互生、具鹽腺，是挖掘耐鹽基因良好的生物材料。1996年Wood等[1]研究發(fā)現(xiàn)，禾本科植物含有甜菜堿醛脫氫酶基因。甘氨酸甜菜堿(Glycine betain，以下簡稱甜菜堿)是以膽堿為底物，絲氨酸為原料，在膽堿單加氧酶的催化下先生成甜菜堿醛，再通過甜菜堿醛脫氫酶(BADH)的氧化作用生成的[2-3]。甜菜堿作為植物中重要的滲透調(diào)節(jié)劑，在植物遭受鹽堿、干旱等逆境脅迫時，幫助植物維持細胞滲透平衡，并可保護蛋白酶活性，激活抗逆基因表達，顯著提高植物的抗逆能力。目前已從菠菜[4]、遼寧堿蓬[5]、異苞濱藜[6]、大麥[7]、結(jié)縷草[8]、鹽節(jié)木[9]、柳樹[10]等植物中克隆出BADH基因。將BADH基因轉(zhuǎn)入小麥[11]、水稻[12]、大豆[13]、玉米[14]、棉花[15]、羽衣甘藍[16]等植物使其耐鹽性或耐旱性得到不同程度的提高。本研究擬從鹽生植物互花米草中克隆BADH基因，對其進行生物信息學(xué)及表達分析，為進一步研究其耐逆功能和分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

互花米草種子采集于山東萊州海濱，浸泡處理后4 ℃保存。將保存的種子種植于基質(zhì)中(1/2椰土+1/2黑土)，在25 ℃、光照/黑暗為16 h/8 h的環(huán)境下培養(yǎng)2周。取長勢一致的植株移到小方盆中，繼續(xù)培養(yǎng)至4～5葉齡[17]。用600 mmol/L的NaCl溶液澆灌4～5葉齡幼苗48 h，剪取幼嫩葉片，液氮速凍后-80 ℃保存，用于BADH基因的克隆。用600 mmol/L的NaCl溶液、20%的 PEG溶液分別對幼苗進行澆灌和噴灑處理，分別脅迫0、3、6、12、24、48 h，每個處理重復(fù)3次。洗樣，剪取幼嫩葉片，液氮速凍后-80 ℃保存，用于BADH基因的表達分析。

大腸桿菌DH5α為煙臺大學(xué)植物發(fā)育分子生物學(xué)實驗室保存；PCR相關(guān)試劑、pMD18-T Vector、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa；BIOZOL RNA Kit購自BIOFLUX公司；Reverse Transcriptase試劑盒購自Promega公司；氨芐青霉素購自Sigma公司；其他試劑多為國產(chǎn)分析純；引物由北京華大六合基因公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 互花米草BADH基因的克隆 取凍存的用于基因克隆的互花米草葉片，液氮研磨，利用BIOZOL RNA Kit提取RNA，使用超微量紫外分光光度儀檢測其純度和濃度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。利用Reverse Transcriptase試劑盒體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)煙臺大學(xué)植物發(fā)育分子生物學(xué)實驗室轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，獲得BADH基因的中間片段，在此基礎(chǔ)上設(shè)計RACE引物(S31-BADH：5′-CCAAGATTACTGAGAGGAAGCCTG-3′；S32-BADH：5′-CCACCTTCAGAGAGACCCTATTGG-3′；S51-BADH：5′-CCAATAGGGTCTCTCTGAAGGTGG-3′；S52-BADH：5′-CAGGCTTCCTCTCAGTAATCTTGG-3′)，以cDNA為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；68 ℃充分延伸10 min。DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，加尾，與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，酶切，挑選陽性克隆送華大基因公司測序。比對分析測序結(jié)果，拼接獲得互花米草BADH全長cDNA序列，登陸NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行Blast比對，確認其為互花米草BADH基因，將其命名為SaBADH基因。根據(jù)拼接獲得的全長cDNA序列，設(shè)計引物(SaBADH1-oxF：5′-CTCTAGACACCCAAAGCCCAAGCTCAGTG-3′；SaBADH1-oxR：5′-GGTACCCACACGACTTCAGCACATGGTAC-3′)，以cDNA為模板，擴增SaBADH基因。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸120 s，35個循環(huán)；68 ℃充分延伸10 min。將擴增產(chǎn)物回收，加尾，連接，轉(zhuǎn)化，酶切，挑選陽性克隆送測序，確認獲得正確的SaBADH基因的pMD18-T 克隆載體。

1.2.2 互花米草BADH基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行Blast比對分析，取部分高度相似(相似度>70%)的同源序列，利用MEGA 6進行同源序列比對，構(gòu)建N-J進化樹，分析SaBADH與其他植物BADH的進化關(guān)系。利用Expasy軟件(https://web.expasy.org/protparam)分析SaBADH蛋白的基本理化性質(zhì)。利用PredictProtein軟件(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測SaBADH的二級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位。利用InterProScan軟件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。利用SWISS-MODEL軟件(https://swissmodel.expasy.org/)進行三維建模，預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 互花米草BADH基因的表達分析 取凍存的用于表達分析的互花米草葉片，用BIOZOL RNA Kit提取RNA，用Reverse Transcriptase試劑盒合成cDNA，稀釋20倍作為qRT-PCR的模板。根據(jù)SaBADH基因的cDNA全長序列，設(shè)計定量引物(SaBADH-RTF：5′-TAAGTGGTCACAGCACACGGAAC-3′，SaBADH-oxR：5′-GGTACCCACACGACTTCAGCACATGGTAC-3′)。以tub為內(nèi)參，進行PCR反應(yīng)得到擴增曲線。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán))。循環(huán)結(jié)束后，從72 ℃緩慢升溫至95 ℃獲得熔解曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003軟件繪圖，利用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。本研究采用單因素方差分析，進行方差齊性檢驗和LSD分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草BADH基因的克隆

采用RACE技術(shù)獲得的SaBADH基因的兩端序列見圖1，將其與本課題組實驗室通過轉(zhuǎn)錄組測序得到的中間片段進行拼接，得到SaBADH基因cDNA的全長序列，在NCBI網(wǎng)站進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)SaBADH與細葉結(jié)縷草、二穗短柄草、高粱氨基酸的BADH相似性分別達到96%、87%、86%，且氨基酸數(shù)量基本相同，確認拼接得到了SaBADH基因。根據(jù)SaBADH基因cDNA的全長序列設(shè)計引物，以cDNA為模板，擴增SaBADH基因(圖1)，獲得SaBADH的克隆載體pMD18-T ∶∶SaBADH。

M：Marker 2000 plus；1：互花米草SaBADH基因5′RACE產(chǎn)物；2：互花米草SaBADH基因3′RACE產(chǎn)物；3：互花米草SaBADH基因全長產(chǎn)物圖1 互花米草SaBADH基因電泳結(jié)果

2.2 互花米草BADH基因的生物信息學(xué)分析

SaBADH基因的cDNA全長1 983 bp，開放閱讀框1 515 bp，編碼504個氨基酸(圖2)。Expasy軟件預(yù)測SaBADH蛋白分子質(zhì)量為54.388 ku，理論等電點為5.45，不穩(wěn)定系數(shù)為33.37，脂肪系數(shù)為88.89，平均親水系數(shù)為-0.080，為穩(wěn)定的親水性蛋白[18]。PredictProtein軟件預(yù)測SaBADH蛋白的二級結(jié)構(gòu)由43.65%的H、17.06%的E、39.29%的L組成，SaBADH蛋白定位于葉綠體。InterProScan分析SaBADH具有堿醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域。SaBADH的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其為橢球形。SaBADH的Blast比對發(fā)現(xiàn)，互花米草與細葉結(jié)縷草、二穗短柄草、高粱的相似性達到86%以上。從N-J進化樹(圖3)中可知，互花米草BADH與結(jié)縷草屬細葉結(jié)縷草BADH親緣關(guān)系最近，其次是短柄草屬二穗短柄草、高粱屬高粱、蜀黍?qū)俟茸拥群瘫究茊巫尤~植物的BADH，與棉花、山萮菜等雙子葉植物的BADH親緣關(guān)系較遠。

單下劃線為葉綠體定位序列；雙下劃線為十縮肽；陰影為酶功能相關(guān)殘基；*為終止密碼子圖2 互花米草BADH的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列

圖3 互花米草和其他植物的BADH系統(tǒng)進化樹

2.3 互花米草BADH基因的表達分析

對在600 mmol/L NaCl和20% 的PEG不同脅迫時間處理下的互花米草的qRT-PCR分析結(jié)果表明(圖4)，隨著處理時間的延長，SaBADH基因的表達呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，分別在處理24、12 h時達到最大值，分別為對照的7、4倍，且與對照相比差異達到極顯著水平，表明SaBADH受NaCl、PEG誘導(dǎo)表達，這與互花米草的耐鹽耐旱有密切關(guān)系。

*、**分別表示在0.05、0.01水平差異顯著圖4 互花米草BADH在NaCl、PEG脅迫下的定量表達分析

3 結(jié)論與討論

BADH是甜菜堿合成過程中的關(guān)鍵酶，在植物耐逆過程中起重要作用[18-20]，隨著全球土地鹽漬化和干旱等非生物脅迫因素的加劇，研究植物的耐逆基因意義愈發(fā)重大。目前，已經(jīng)克隆出多種植物耐逆相關(guān)基因，主要有滲透物質(zhì)合成酶基因、功能蛋白基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因等[21]。本研究通過RACE技術(shù)，從互花米草中克隆出BADH基因的全長cDNA序列。生物信息學(xué)分析預(yù)測SaBADH為穩(wěn)定的具有橢球形三級結(jié)構(gòu)的親水性蛋白，定位于葉綠體。已有報道指出，BADH定位于葉綠體的序列為QLFIDGE[22]，推測SaBADH蛋白的氨基酸序列中的QLFIGGE指導(dǎo)其定位到葉綠體。InterProScan分析SaBADH具有堿醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域。有報道指出，堿醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域有保守的VTLELGGKSP十縮肽[23]，推測SaBADH蛋白的氨基酸序列中VSLELGGKSP是該酶的保守十縮肽。系統(tǒng)進化分析顯示，SaBADH是序列保守的蛋白質(zhì)，單子葉與雙子葉BADH、禾本科與非禾本科BADH在進化上有一定的差異，這與植物分類學(xué)上的親緣關(guān)系一致。為進一步探討SaBADH的耐鹽機制，本研究利用qRT-PCR儀對SaBADH在600 mmol/L NaCl、20%的PEG脅迫處理下的表達量進行了相對定量表達研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SaBADH的相對表達量發(fā)生了很大變化，這說明SaBADH受NaCl、PEG誘導(dǎo)表達。在NaCl脅迫處理時，隨著處理時間的延長SaBADH的相對表達量逐漸增加，處理24 h時達到最大，約為對照的7倍，且差異達到極顯著水平，之后SaBADH的相對表達量下降；在PEG脅迫處理時，隨著處理時間的延長SaBADH的相對表達量逐漸增加，在處理12 h時達到最大，約為對照的4倍，且差異達到極顯著水平，之后SaBADH的相對表達量下降。由此可見，SaBADH在鹽脅迫和干旱脅迫下基因表達上調(diào)，通過增加SaBADH的表達量來抵御鹽和干旱脅迫對自身的毒害，這與互花米草在植物耐逆機制方面有較保守的功能密切相關(guān)。

隨著土壤鹽漬化和干旱問題的日益嚴(yán)重，利用基因工程技術(shù)培育耐鹽耐旱新品種對于開發(fā)利用鹽堿、干旱土地有重要意義。本實驗室下一步將構(gòu)建SaBADH的過量表達載體，轉(zhuǎn)模式植物擬南芥，進一步研究SaBADH的耐逆功能與分子機制。