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        激動核受體RXR對大鼠心肌細胞饑餓損傷中自噬和凋亡的雙重調(diào)控作用

        2018-12-07 09:19:06單培仁余靈芳周昌鉆朱千里黃周青陳晨
        浙江醫(yī)學(xué) 2018年22期
        關(guān)鍵詞:饑餓百分比孵育

        單培仁 余靈芳 周昌鉆 朱千里 黃周青 陳晨

        缺血性心臟病,尤其是急性心肌梗死,在全球有較高的發(fā)病率和病死率。雖然緊急再灌注治療可降低病死率,但梗死后心室重構(gòu)導(dǎo)致的心力衰竭仍是一個非常嚴重的問題。細胞自噬和凋亡發(fā)生貫穿于心肌梗死后的整個病理生理過程[1-2]。凋亡是細胞程序性死亡的一種形式,抑制凋亡可改善心肌梗死后的心臟功能[2]。自噬是細胞降解和回收細胞器和長壽蛋白的主要代謝途徑,在心肌細胞中自噬起著雙重作用,在不同的病理條件下表現(xiàn)出保護或有害作用,調(diào)控自噬已成為當(dāng)前心血管疾病治療的重要靶點[1-3]。

        維甲類X受體(retinoid X receptor,RXR)是眾多核受體中的獨特一員,能與其它眾多細胞核受體發(fā)生交互作用,在細胞增殖、分化、凋亡等方面發(fā)揮重要功能[4-5]。我們前期的研究表明,激動核受體RXR可以保護心肌細胞氧化應(yīng)激損傷,但其機制還不是很明確,尤其是在自噬水平中的調(diào)控作用[6]。為此,我們采用大鼠心肌細胞株H9c2建立無糖無血清(serum and glucose deprivation,SGD)饑餓狀態(tài)損傷模型,用RXR激動劑9-順式維甲酸 (9-cis retinoid acid,c-RA)、RXR 拮抗劑HX531進行干預(yù),觀察激動核受體RXR對H9c2細胞SGD損傷的保護作用,探討其可能機制,現(xiàn)報道如下。

        1 材料和方法

        1.1 主要試劑 無糖Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM,美國 Gibco公司,批號:1930192,規(guī)格:500ml)、高糖 DMEM(美國 Gibco 公司,批號:8118168,規(guī)格:500ml)、FBS(美國 Gibco 公司,批號:1828728,規(guī)格:500ml)、c-RA(美國 Sigma 公司,批號:533-3-8,規(guī)格:10mg),JC-1試劑盒(美國 Molecular Probes公司,貨號:M34152,規(guī)格:1 kit),NucViewTM488 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3試劑盒(美國Biotium,Inc,批號:10402,規(guī)格:100μl),Western blot法檢測所用的兔多克隆抗Bax(美國Cell Signaling公司,批號:2772s,規(guī)格:100μl)、Bcl-2(美國 abcam 公司,批號:ab59348,規(guī)格:100μg)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9(美國 Cell Signaling公司,批號:20750,規(guī)格:100μl)及 β-肌動蛋白抗體(美國 Cell Signaling 公司,批號:4970,規(guī)格:100μl),HX531 由日本東京大學(xué)Dr.Hiroyuki Kagech贈送。

        1.2 細胞株及培養(yǎng) 將大鼠心肌細胞株H9c2(購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心)用含10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),細胞生長密度達90%時予以3∶1傳代。

        1.3 細胞分組及培養(yǎng) 將傳代接種于培養(yǎng)板生長24h的細胞按隨機數(shù)字表法分為4組并按以下方法干預(yù):(1)對照組(C組):10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基中加入0.1%的二甲基亞砜培養(yǎng)6h;(2)SGD組:無糖DMEM中培養(yǎng)6h;(3)RA組:向培養(yǎng)液中加入終濃度為100nmol/L c-RA預(yù)處理1h后,在無糖DMEM中培養(yǎng)6h;(4)HX組:向培養(yǎng)液中加入終濃度2.5μmol/L HX531預(yù)處理0.5h,再加入終濃度為100nmol/L c-RA處理1h后,在無糖DMEM中培養(yǎng)6h。干預(yù)后采用透射電鏡檢測心肌細胞自噬小體。

        1.4 MTT法檢測細胞活力 用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度,每孔200μl,各實驗組的藥物處理后,每孔加入5mg/ml MTT試劑20μl,37℃孵育4h,棄上清液,每孔加入二甲基亞砜 200μl,37℃孵育 20min,用酶標(biāo)儀 Elx800 microplate reader(美國BioTek)在波長570nm下檢測光密度(空白對照為不加細胞只加培養(yǎng)液,空白孔調(diào)零)。

        1.5 JC-1流式細胞法檢測細胞凋亡百分比及Caspase-3活力 根據(jù)細胞熒光顏色和強度不同判斷凋亡細胞,計數(shù)10 000個細胞后,以凋亡細胞數(shù)除以10 000作為細胞凋亡百分比。收集各組細胞,加入5μg/ml JC-1探針 37°C孵育30min,溫PBS洗1次,上流式細胞儀(FACS Calibur,美國BD公司)檢測細胞凋亡百分比(激發(fā)光488 nm,散發(fā)光 530nm 和 585nm)[6-7]。Caspase-3活化是細胞凋亡的重要標(biāo)志,本研究采用流式法測量平均熒光強度(MFI)來反映Caspase-3活力。以1×105/孔細胞密度接種于6孔板中,在各組處理后,用胰酶消化,PBS重懸,加入2μmol/L NucView 488 Caspase-3底物避光孵育15min,PBS洗1次,上流式細胞儀檢測(激發(fā)光488nm,散發(fā)光530nm),求得MFI,以C組所測的MFI為1,其余孔測得的MFI與其比值來表示Caspase-3活力。

        1.6 Western blot法檢測蛋白表達 包括凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9蛋白表達,以及自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1表達。收集經(jīng)試驗處理的細胞,加入細胞裂解液,4℃搖床上裂解20min,在4℃下以12 000r/min離心15min,收集上清液即為全細胞裂解液。用BCA法定量蛋白,取等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等步驟后,用免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑孵育后,X線膠片曝光,曝光顯影的目的條帶用Image J處理軟件進行半定量分析,以內(nèi)參為參考標(biāo)準(zhǔn)計算出目的條帶標(biāo)準(zhǔn)化后的光密度值,并以此判斷蛋白的表達水平。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS 6.12統(tǒng)計軟件,測得計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 4組心肌細胞活力的比較 見圖1。

        圖1 4組心肌細胞活力的比較(與C組比較,*P<0.01;與SGD組比較,△P<0.01)

        由圖1可見,與C組比較,SGD組和HX組心肌細胞活力均下降(均P<0.01);與SGD組比較,RA組心肌細胞活力上升(P<0.01)。

        2.2 4組心肌細胞凋亡百分比比較 見圖2。

        由圖2可見,與C組比較,SGD組和HX組心肌細胞凋亡百分比均上升(均P<0.01);與SGD組比較,RA組心肌細胞凋亡百分比明顯下降(P<0.01)。

        2.3 4組心肌細胞Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白水平比較 見圖3。

        圖2 4組心肌細胞凋亡百分比比較(a:JC-1結(jié)合流式細胞法測量細胞凋亡百分比,右下象限表示凋亡細胞;b:各組凋亡百分比條狀圖;與 C 組比較,*P<0.01;與 SGD 組比較,△P<0.01)

        圖 3 4組心肌細胞 Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白水平比較(a:Westernblot法檢測Bcl-2、Bax及活性片段Caspase-9蛋白表達電泳圖;b:半定量分析各蛋白表達條狀圖,設(shè)C組Bax/Bcl-2、Caspase-9表達為1,與C 組比較,*P<0.01,與SGD 組比較,△P<0.01)

        由圖3可見,SGD干預(yù)可誘導(dǎo)Bcl-2表達下調(diào),Bax表達上調(diào),引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值上升,并伴有Caspase-9蛋白水平增高。與C組比較,SGD組和HX組心肌細胞Bax/Bcl-2比值和Caspase-9蛋白水平均上升(均P<0.01);與SGD組比較,RA組心肌細胞Bax/Bcl-2比值和Caspase-9蛋白水平明顯下降(均P<0.01)。

        2.4 4組Caspase-3活力比較 見圖4。

        圖4 4組Caspase-3活力比較(a:波峰右移表示熒光增強,反映Caspase-3活力增高;b:各組Caspase-3活力條狀圖,以各組與C組M FI的比值表示,與對照組比較,*P<0.01,與SGD組比較,△P<0.01)

        由圖4可見,SGD組MFI值波峰明顯右移,MFI值為C組的2.3倍(P<0.01);而RA組波峰出現(xiàn)明顯左移,MFI值僅為C組的1.3倍,明顯低于SGD組(P<0.01);HX組波峰與SGD組相似,MFI值顯著高于C組(P<0.01)。

        2.5 4組間自噬水平及相關(guān)蛋白水平的比較 見圖5。

        圖5 4組自噬水平及相關(guān)蛋白水平的比較(a:透射電鏡下觀察細胞內(nèi)自噬小體;b:W est ern bl ot法檢測Becl i n 1及LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達電泳圖;c:半定量分析各蛋白表達條狀圖,設(shè)C組Becl i n 1及LC3-Ⅱ/Ⅰ表達為 1,與C組比較,*P<0.01,與SGD組比較,△P<0.01)

        由圖5可見,C組中細胞質(zhì)內(nèi)細胞器完整,而SGD組和HX組自噬小體數(shù)增加,其內(nèi)含有被吞噬的線粒體等結(jié)構(gòu),部分呈空泡樣改變,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ比值上升,Beclin 1表達增加(均P<0.01);RA組心肌細胞自噬小體數(shù)量明顯減少,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值下調(diào),Beclin 1蛋白表達水平降低(均P<0.01)。

        3 討論

        盡管自噬的概念早在幾十年前就已形成,但它在病理過程中的確切作用仍不清楚。心肌細胞是不可再生的終末分化細胞,自噬在穩(wěn)定心肌細胞內(nèi)環(huán)境,維持正常的心臟結(jié)構(gòu)和功能中起著非常重要的作用[1-3]。

        本研究中建立了心肌細胞饑餓模型,結(jié)果顯示細胞凋亡和自噬水平均明顯升高,這與既往的文獻報道一致[8-9]。心肌細胞營養(yǎng)缺乏是一種常見的臨床事件,它介導(dǎo)各種心臟缺血過程,如冠心病和心力衰竭。為了應(yīng)對饑餓,自噬上調(diào),雙膜自噬體將損害的細胞器或部分細胞質(zhì)隔離,并與溶酶體融合水解酶,為能量生成提供了內(nèi)在的營養(yǎng)來源,從而促進生存[8-9]。

        我們發(fā)現(xiàn),激動RXR能明顯抑制饑餓狀態(tài)下的凋亡水平,其與抑制線粒體凋亡通路相關(guān)。早期就有研究顯示RXRα突變胎鼠在心肌能量代謝上存在明顯異常,超微結(jié)構(gòu)顯示線粒體數(shù)量增多,但ATP含量卻明顯減少,說明RXRα在維持心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能中存在重要作用。而線粒體是細胞中維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定非常重要的細胞器[10]。所以我們認為,c-RA在激動RXR后,穩(wěn)定了線粒體膜電位,穩(wěn)定了細胞內(nèi)環(huán)境,減少外源性有害物質(zhì)刺激誘發(fā)凋亡作用。這與既往的研究類似[6],但RXR受體在心肌細胞中的自噬調(diào)控作用尚不清楚。

        在本研究中,我們也發(fā)現(xiàn)激動RXR能抑制自噬水平,增加心肌細胞活力。這也間接說明了在當(dāng)前的饑餓狀態(tài)模型下,自噬是有害的,這與我們前期的研究類似:在心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷中自噬起到致命性作用,抑制自噬可保護心肌細胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷,而增強自噬將惡化心肌損傷[7]。既往對自噬的功能意義一直存在諸多爭議,比如即使在相同的病理條件下(如饑餓),自噬既能發(fā)揮促生存作用,又存在導(dǎo)致死亡的風(fēng)險。因此,目前認為自噬的程度似乎是決定它將發(fā)揮保護或有害作用的關(guān)鍵[11]。

        自噬和凋亡在饑餓反應(yīng)中同時發(fā)生,兩者間的相互作用是決定程序性細胞死亡的關(guān)鍵[12]。但它們間相互作用的確切機制尚不清楚,目前認為Beclin1和Bcl-2家族不僅是自噬和凋亡信號通路發(fā)生交互作用的靶點,而且也可能是平衡自噬強度的潛在靶點,自噬現(xiàn)象究竟是誘導(dǎo)細胞存活還是死亡可能取決于Bcl-2與Beclin1之間的平衡[12-14]。Bcl-2是抗凋亡蛋白中重要成員,在線粒體外膜發(fā)揮作用,以維持膜的完整性。Beclin 1能與Bcl-2發(fā)生相互作用,被認為是自噬的重要調(diào)控因子。Beclin 1與Bcl-2家族的抗凋亡多域蛋白相互作用,尤其是Bcl-2及其同源物Bcl-X(L),其BH3域為同時具有親水和疏水部分的α螺旋,與Bcl-2/Bcl-X(L)的疏水性裂隙結(jié)合[15]。研究表明,Bcl-2與Beclin1的相互作用通過干擾自噬啟動子復(fù)合物Beclin1/hVps34的形成和活性,導(dǎo)致自噬的抑制。本研究發(fā)現(xiàn)激動RXR能上調(diào)Bcl-2蛋白,同時下調(diào)Beclin 1蛋白,這說明RXR可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Beclin1蛋白表達,而發(fā)揮抗凋亡和抗自噬作用,但具體的上游通路還有待進一步研究。

        總之,本研究證明了激動RXR在饑餓狀態(tài)下抑制心肌細胞凋亡和自噬的發(fā)生,可保護心肌細胞在饑餓狀態(tài)下的生存。

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