葉挺宇 盧湧湧 潘悅 黃錫璽 楊宇 蔡健

高血壓是引起男性陰莖勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）的重要因素之一，臨床流行病學(xué)研究表明高血壓人群ED發(fā)病率高達(dá)24%～32%，是正常人群的2～3倍[1-2]。高血壓性ED的發(fā)生機(jī)制涉及多方面因素，其中陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞（corpus cavernosum smooth muscle cells，CCSM）表型轉(zhuǎn)化學(xué)說是近年來提出的一個全新的研究方向。本課題組前期研究結(jié)果顯示高血壓大鼠CCSM中出現(xiàn)了細(xì)胞表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，即收縮型細(xì)胞表型標(biāo)志物堿性調(diào)寧蛋白（calponin1，Cnn1）和合成型細(xì)胞表型標(biāo)志物骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化[3]，這種轉(zhuǎn)化達(dá)到一定程度最終可能成為ED發(fā)生的機(jī)制之一[4]。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）是一種生物活性多肽，其主要作用包括擴(kuò)張周圍血管、保護(hù)缺血心肌以及抑制平滑肌細(xì)胞增殖等[5]，在心血管領(lǐng)域的研究中已經(jīng)證實了CGRP可以逆轉(zhuǎn)血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[6-7]，那么CGRP對于高血壓性ED大鼠CCSM是否發(fā)揮著相似的作用？本研究將CGRP作用于高血壓大鼠CCSM，了解其對高血壓性ED大鼠CCSM表型轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 14周齡雄性SPF級自發(fā)性高血壓Wistar大鼠（SHR）20只（體質(zhì)量 180～250g）及其同系正常血壓健康大鼠（WKY）10 只（體質(zhì)量200～265g），由上海斯萊克實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2010-0005。所有大鼠飲自來水、飼普通大鼠飼料；置于溫度25～32℃，濕度60%～85%，12h晝夜交替環(huán)境中喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑 阿樸嗎啡、MTT、CGRP（美國Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)液、FBS（美國Hyclone公司）；兔抗大鼠平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白（α-SM-Actin）單克隆抗體（英國Abcam公司）；SABC免疫試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；DMSO（廣州威佳科技有限公司）；實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Select Master Mix（日本TOYOBO公司）

1.3 方法

1.3.1 體質(zhì)量和血壓測量 在同一時間由同一人對各組大鼠體質(zhì)量和血壓進(jìn)行測量，其中大鼠血壓的測量方法是通過BP-2000大鼠無創(chuàng)血壓儀（由溫州醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供）測量大鼠尾部動脈收縮壓。

1.3.2 大鼠勃起功能測定及分組 于大鼠頸部皮膚松弛處皮下注射阿樸嗎啡100μg/kg，觀察、記錄30min內(nèi)大鼠陰莖勃起次數(shù)，計數(shù)陰莖勃起的標(biāo)準(zhǔn)以陰莖體充血、膨大增長及露出末端陰莖為勃起1次。SHR大鼠中無陰莖勃起的歸為高血壓勃起功能障礙（HBP-ED）組，出現(xiàn)陰莖勃起的歸為高血壓（HBP）組，WKY大鼠歸為對照組。

1.3.3 大鼠CCSM的原代培養(yǎng)、鑒定及分組 斷頸椎處死大鼠，在75%乙醇溶液中浸泡約5min。無菌條件下切開皮膚，分離、切取陰莖組織，移入PBS中，剔除陰莖白膜、尿道、血管及周圍結(jié)締組織。將海綿體組織剪成1～2mm大小組織塊，按0.5cm的間隔放置到涂有20%FBS的無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置5h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊與培養(yǎng)液接觸。3～4d后見有較多細(xì)胞從組織塊游離出，剔除組織塊，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至80%融合時，予以傳代。細(xì)胞傳代至第2代后，采用兔抗大鼠平滑肌細(xì)胞α-SM-Actin單克隆抗體標(biāo)記CCSM，并經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。然后將CCSM分為HBPED組、HBP組和對照組3組，加入作用濃度為0（即以PBS液作為陰性對照試劑）、1、10和100nmol/L的CGRP，并進(jìn)一步檢測CGRP作用后CCSM的活性及Cnn1和OPN mRNA的表達(dá)水平。

1.3.4 細(xì)胞活性檢測 采用MTT法。細(xì)胞按5×103/L密度接種于96孔板中，每孔體積200μl，各組細(xì)胞分別設(shè)置5個復(fù)孔，置于含0.5%FBS的DMEM液培養(yǎng)中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h。加入各濃度CGRP，繼續(xù)孵育48h。每孔再加入MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，吸出上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶完全溶解。采用酶標(biāo)儀檢測各組CCSM在570nm處的吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（OD對照-ODCGRP）/OD對照×100%。

1.3.5 Cnn1和OPN mRNA表達(dá)水平檢測 采用實時熒光定量PCR法。將各組細(xì)胞接種于50ml培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞完全貼壁后，加入各濃度CGRP，繼續(xù)孵育48h。0.25%胰酶消化、吹打、重懸各組細(xì)胞，使用Trizol提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA的含量和純度。所有引物均由上海Invitrogen（中國）公司設(shè)計合成。內(nèi)參基因為三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。OPN上游引物：5′-ACATCAGAGCCAGAGTT-3′，下游引物：5′-TACATGGTGTCTGCATG-3′；Cnn1 上 游 引 物 ：5′-ACACGCT －CAACGTCAGCTT-3′，下游引物：5′GCTCGTCCAGCTCTGGATAT 3′；GAPDH 上游引物：5′-GCCAGCCTCGTCTCATAGACA-3′，下游引物：5′-AGAGAAGGCAGCCCTGGTAAC-3′。按照SYBR Select Master Mix試劑盒說明書制備cDNA和PCR體系。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 3min、95℃變性 30s、60℃退火 30s、72℃延伸 30s，共40個循環(huán)。儀器自動進(jìn)行熔解曲線分析。每個樣品中目的基因相對于空白對照組樣品的表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。同一實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠實驗中情況 所有實驗大鼠中，SHR大鼠有1只在飼養(yǎng)過程中死亡，其余19只測量尾動脈收縮壓均在180mmHg以上；所有WKY大鼠尾動脈收縮壓均未超過140mmHg。SHR和WKY大鼠體質(zhì)量和血壓比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

表1 SH R和W KY大鼠體質(zhì)量和血壓比較

2.2 大鼠勃起功能測定及分組結(jié)果 注射阿樸嗎啡30min后，SHR大鼠中有8只未見陰莖勃起，歸為HBPED組；其余11只SHR大鼠可見陰莖勃起，歸為HBP組。對照組10只WKY大鼠注射阿樸嗎啡后均能誘導(dǎo)出陰莖勃起。SHR大鼠勃起率為57.9%，明顯低于WKY大鼠的勃起率100.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 大鼠CCSM培養(yǎng)結(jié)果及鑒定 傳代至第2代的大鼠CCSM形態(tài)上呈梭形，SHR和WKY大鼠CCSM免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性率為（91.12±1.53）%，鏡下可見梭形平滑肌細(xì)胞淺黃色胞質(zhì)，其內(nèi)可見染成深黃色的肌動蛋白，結(jié)果提示經(jīng)原代培養(yǎng)所獲得的CCSM純度較高。

2.4 CGRP對細(xì)胞活性的影響 HBP-ED組、HBP組和對照組在不同濃度CGRP作用下增殖抑制率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。CGRP對HBP-ED組、HBP組和對照組3組大鼠CCSM的增殖抑制率依次遞減，提示CGRP對高血壓性ED大鼠CCSM的抑制作用最明顯，見表2。3組大鼠CCSM在100nmol/L濃度下的增殖抑制率顯著高于在1和10nmol/L濃度下的增殖抑制率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；但3組大鼠CCSM在1和10nmol/L濃度下的增殖抑制率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），提示達(dá)到一定濃度后細(xì)胞增殖抑制率隨著CGRP濃度增加而升高，CGRP作用的最佳濃度可能是100nmol/L。

表2 CGRP對各組大鼠CCSM增殖抑制率比較（%）

2.5CGRP對Cnnl和OPN mRNA表達(dá)水平的影響 當(dāng)CGRP作用的終濃度為1、10nmol/L時，3組大鼠CCSM的Cnnl和OPN mRNA表達(dá)水平與各自組內(nèi)0nmol/L濃度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。當(dāng)CGRP作用的終濃度為100nmol/L時，對照組Cnnl和OPN mRNA表達(dá)水平與組內(nèi)0nmol/L濃度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但HBP組和HBP-ED組Cnnl mRNA表達(dá)水平較組內(nèi)0nmol/L濃度均上調(diào)（均P＜0.05），OPN mRNA表達(dá)水平較組內(nèi)0nmol/L濃度均下調(diào)（均P＜0.05），提示CGRP達(dá)到一定濃度（100nmol/L）后可使高血壓性ED大鼠CCSM表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)變，見表3。

表3 不同濃度CGRP對各組大鼠CCSM Cnn1和OPN m RNA表達(dá)水平的影響

3 討論

平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化這一概念最初是在對血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的研究中提出的，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，可以將VSMC分為收縮型和合成型兩種，當(dāng)機(jī)體處于發(fā)育的不同階段或在疾病狀態(tài)下時，VSMC可從收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，同時細(xì)胞重新獲得增殖能力，這一系列變化過程即稱為表型轉(zhuǎn)化[8]。細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞獲得異常增殖能力最終可以導(dǎo)致血管重構(gòu)，這一病理變化是動脈粥樣硬化等血管病變發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。陰莖海綿體組織也具有平滑肌結(jié)構(gòu)，而且其功能與血管平滑肌相類似[9]，因此筆者認(rèn)為兩者在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中存在著相似的病理學(xué)變化基礎(chǔ)。筆者在前期研究中已初步證實了在糖尿病、高血壓性ED動物模型的陰莖海綿體平滑肌組織中存在細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，并與ED相關(guān)[4，10]。

CGRP是人類用分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的第一個活性多肽，含有37個氨基酸，分子量3 786.91。人類的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中CGRP含量較高，心血管系統(tǒng)中也有廣泛分布的CGRP神經(jīng)纖維，此外在陰莖海綿體平滑肌及其血管周圍也有豐富的CGRP及其受體存在[11]。CGRP是目前已知的人體內(nèi)最強(qiáng)的舒血管物質(zhì)，具有強(qiáng)大的擴(kuò)張周圍血管、心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、痛覺調(diào)制、免疫調(diào)節(jié)和抑制平滑肌細(xì)胞增生等作用。在心血管系統(tǒng)疾病方面的研究中發(fā)現(xiàn)CGRP對人VSMC的增殖有抑制作用，并且其對VSMC的表型轉(zhuǎn)化有逆轉(zhuǎn)作用，即能夠驅(qū)動VSMC由合成型向收縮型轉(zhuǎn)化[6-7]。筆者的前期研究也已經(jīng)初步證實了在體外培養(yǎng)的糖尿病性ED大鼠CCSM模型中，CGRP可使該CCSM表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)化，即發(fā)生逆轉(zhuǎn)化[12]。

本研究立足于CCSM表型轉(zhuǎn)化在高血壓性ED發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮著重要作用這一理論基礎(chǔ)，探討CGRP對高血壓性ED大鼠CCSM表型轉(zhuǎn)化的影響。首先，筆者采用不同濃度CGRP作用于高血壓性ED大鼠CCSM，發(fā)現(xiàn)不同濃度CGRP對高血壓性ED大鼠CCSM的增殖均有抑制作用，特別是在100nmol/L濃度下CGRP發(fā)揮的抑制作用尤為明顯。其次，比較各組表型標(biāo)志物的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)HBP-ED組Cnnl mRNA表達(dá)水平最低、OPN mRNA表達(dá)水平最高，從而在細(xì)胞水平證實了高血壓狀態(tài)下的CCSM存在表型轉(zhuǎn)化。再次，將不同濃度CGRP作用于各組大鼠CCSM，結(jié)果表明CGRP達(dá)到一定濃度（100nmol/L）后可使高血壓及高血壓性ED組大鼠CCSM表型從合成型向收縮型轉(zhuǎn)變，即發(fā)生表型逆轉(zhuǎn)化，而CGRP對對照組大鼠CCSM的表型標(biāo)志物表達(dá)水平無明顯影響。

CCSM表型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚未完全明了。在對VSMC表型轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，這一病理變化過程中存在諸多正負(fù)調(diào)節(jié)因素，通過影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制從而發(fā)揮作用，目前研究較多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）途徑等[13]。陳光慧等[14]研究發(fā)現(xiàn)CGRP可以上調(diào)高血壓相關(guān)基因（HRG-1）表達(dá)，從而抑制MAPK途徑，最終起到調(diào)控VSMC增殖的效應(yīng)。而HRG-1表達(dá)產(chǎn)物不僅可以抑制VSMC增殖，還參與了VSMC從處于增殖狀態(tài)的合成型向收縮型轉(zhuǎn)化的病理變化過程。也有研究表明CGRP能顯著抑制VSMC增殖及表型轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展、抑制細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路中的蛋白磷酸化以及減弱胞質(zhì)中蛋白激酶C的活性等有關(guān)[15]。CCSM在結(jié)構(gòu)、功能方面與VSMC具有很大相似性，筆者推斷或許其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制也是相類似的，下一階段可以此為切入點(diǎn)探索CGRP影響高血壓性CCSM表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制。

本研究通過CGRP作用于體外培養(yǎng)高血壓性ED大鼠CCSM模型，初步證實了CGRP可逆轉(zhuǎn)高血壓性ED大鼠CCSM的表型轉(zhuǎn)化，但其具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。