尉捷 張奇

摘要：目的 探究甘草次酸與茶堿聯(lián)合使用的體內、體外平喘作用機制。方法 實驗分為空白對照組、模型組、甘草次酸組、不同濃度茶堿組及甘草次酸+茶堿組，ELISA檢測人支氣管平滑肌細胞炎癥模型細胞內環(huán)磷酸腺苷（cAMP）變化；建立離體氣管體外模型，比較藥物改善乙酰膽堿引發(fā)的氣管收縮率；建立豚鼠哮喘模型，測定豚鼠延喘時間。結果 各濃度茶堿均可升高細胞內cAMP含量，抑制乙酰膽堿引起的體外氣管收縮，延長延喘時間，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；甘草次酸單獨使用時無顯著效果；當二者聯(lián)合使用時，甘草次酸+茶堿組與相同濃度茶堿組比較，cAMP含量升高，氣管收縮率降低，延喘時間增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 甘草次酸與茶堿在平喘治療中聯(lián)用，可提高藥效，減少茶堿使用量。

關鍵詞：茶堿；甘草次酸；平喘；氣管平滑??；豚鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.012

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）12-0045-03

Abstract： Objective To investigate the mechanism of glycyrrhetic acid combined with theophylline for in vivo and in vitro combating asthma. Methods The experiment was divided into blank control group， model group， glycyrrhetic acid group， different concentrations of theophylline groups and glycyrrhetic acid + theophylline group. The intracellular cAMP changes were measured by ELISA method. An in vitro tracheal model was established to compare the effects of medicine on acetylcholine-induced muscle contraction. Guinea pig asthma model was established， and asthmatic time in guinea pigs was detected. Results Theophylline high， medium， and low concentrations could increase intracellular cAMP levels， inhibit acetylcholine-induced tracheal contractions in vitro， and prolong the delay time for asthma， with statistical significance （P<0.05）； The glycyrrhetic acid has no significant effect when used alone； When glycyrrhetic acid combined with theophylline， compared with theophylline group of the same concentration， the glycyrrhetic acid + theophylline group had higher cAMP content， lower tracheal contraction rate， and longer delay time for asthma， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Glycyrrhetic acid combined with theophylline used in combating asthma can improve efficacy and reduce the dosage of theophylline.

Keywords： theophylline； glycyrrhetic acid； combating asthma； tracheal smooth muscle； guinea pig

茶堿（theophylline）是茶葉中的重要成分，是一種磷酸二酯酶（PDE）抑制劑，常用于哮喘治療，有舒張支氣管平滑肌作用，在血漿濃度小于10 mg/L時即可對遲發(fā)型哮喘反應產生影響，但由于其非選擇性抑制，對中樞神經、心血管及胃腸道等系統(tǒng)均表現(xiàn)出一定的不良反應，限制了其臨床應用[1]。甘草作為一種補益類中藥，有調和諸藥之效。甘草含有多種化學成分，其中甘草次酸（glycyrrhetic acid）作為甘草類化合物發(fā)揮實質功效的重要中間物質，有顯著的腎上腺皮質激素樣作用，具有抗炎、增強機體免疫力、提高生理機能、抑制癌細胞生長等功效，常用于各種原因引起的上呼吸道感染[2-5]。甘草次酸經腸內微生物作用，部分生成3-表-甘草次酸及少量3-脫氫甘草次酸，進而發(fā)揮其活性[6]。本研究分別在細胞、離體組織和動物水平，研究甘草次酸與茶堿聯(lián)合使用在平喘中的作用，以期在提高或保持茶堿類藥物原有治療效果的情況下，減少茶堿使用量，進而降低其毒副作用，為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞株

SPF級英國種豚鼠（短毛種）48只，2月齡，體質量（350±10）g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2008- 0003。飼養(yǎng)于溫度（21±2）℃、相對濕度30%～70%的環(huán)境，每日光照12 h，通風良好，自由攝食飲水。人支氣管平滑肌細胞株（human bronchial smooth muscle cells，HBSMC），美國Sciencell公司。

1.2 藥物

甘草次酸（編號588965）、茶堿（編號340523）、磷酸組胺（編號H7375）、乙酰膽堿（編號A0084），百靈威科技有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

平滑肌細胞培養(yǎng)基（SMCM），美國Sciencell公司；環(huán)磷酸腺苷（cAMP）ELISA試劑盒，美國BioVision公司；Krebs-Henseleit緩沖液，美國Sigma公司。酶標儀（美國Bio-rad公司），恒溫平滑肌槽、張力傳感器、生物信號采集系統(tǒng)（成都盟泰科技有限公司），超聲波霧化器（北京亞都科技股份有限公司）。

1.4 細胞藥物處理

將復蘇后的HBSMC以SMCM稀釋至106/mL，加入96孔板，100 ?L/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%時，將其分為9組。模型組加入終濃度10 ?g/mL腫瘤壞死因子-α（TNF-α）；空白對照組用SMCM；藥物干預組分別在加入終濃度10 ?g/mL TNF-α后再加入不同濃度藥物，甘草次酸組加入終濃度10-9 mol/L甘草次酸，茶堿低、中、高組分別加入終濃度10-9、10-8、10-7 mol/L茶堿，甘草次酸+茶堿低、中、高組分別加入終濃度10-9、10-8、10-7 mol/L茶堿和10-9 mol/L甘草次酸。每組用8個平行，37 ℃、5%CO2孵育12 h。

1.5 環(huán)磷酸腺苷測定

參照cAMP ELISA試劑盒說明書，傾倒上述細胞的培養(yǎng)液，加入150 ?L裂解液，充分裂解、靜置后，吸取100 ?L上清液加入固定有cAMP抗體的酶標板。再加入100 ?L HRP-cAMP，37 ℃孵育1.5 h，磷酸鹽緩沖液充分洗滌，然后加入顯色液顯色，于450 nm波長處測定吸光度。以空白對照組為單位1（100%），以與空白對照組比值×100%計算cAMP，以模型組和各給藥組與空白對照組比值表示cAMP的變化情況。

1.6 豚鼠離體氣管收縮實驗

選6只豚鼠，擊頭致昏，剝取氣管后，將每只豚鼠氣管剪成4 mm×8 mm的氣管片，分別固定于Krebs-Henseleit緩沖液（20 mL）、37 ℃恒溫管中，并與張力傳感器連接，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，靜息負荷1 g重物后，加入10-5 mol/L乙酰膽堿，以生物信號采集系統(tǒng)收集數(shù)據(jù)，記錄最大收縮效應，作為空白對照組。隨后，以Krebs-Henseleit緩沖液反復沖洗該氣管片，直至肌張力恢復至基線，按“1.4項”下藥物處理分別加入待測藥物和10-5 mol/L乙酰膽堿，以生物信號采集系統(tǒng)收集數(shù)據(jù)，測量收縮曲線，計算收縮率[7]。收縮率（%）=（給藥前曲線高度-給藥后曲線高度）÷給藥前曲線高度×100%。

1.7 磷酸組胺致敏豚鼠哮喘實驗

將雌雄各半42只豚鼠逐個標記后置玻璃鐘罩內，用超聲波霧化器噴入（0.5 mL/min）0.1%磷酸組胺+2%乙酰膽堿溶液10 s引喘，以秒表記錄每個豚鼠發(fā)生哮喘時間。將豚鼠隨機分為空白對照組（予生理鹽水），甘草次酸（0.5 mg/kg）組，茶堿高（5 mg/kg）、中（2.5 mg/kg）、低（1.25 mg/kg）組，甘草次酸+茶堿中、低組，每組6只，雌雄各半，用超聲波霧化器噴入（0.5 mL/min）不同濃度和配比的藥物，連續(xù)噴霧10 s后，用超聲波霧化器以相同的速度噴入0.1%磷酸組胺+2%乙酰膽堿溶液10 s引喘，以秒表記錄豚鼠哮喘潛伏時間，計算延喘時間百分比[8]。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示。采用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甘草次酸與茶堿聯(lián)用對人支氣管平滑肌細胞株細胞內環(huán)磷酸腺苷水平的影響

與模型組比較，茶堿高、中、低組cAMP水平顯著升高（P<0.05），甘草次酸組升高不明顯（P>0.05），當二者聯(lián)合使用時，與單獨使用相同濃度茶堿組比較，cAMP比例顯著升高（P<0.05）。見圖1。

2.2 甘草次酸與茶堿聯(lián)用對豚鼠離體氣管收縮的影響

高、中、低濃度茶堿組均呈劑量依賴性地抑制氣管收縮（P<0.05）；甘草次酸組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；中、低濃度茶堿與甘草次酸聯(lián)合使用時，與相同濃度茶堿組比較，可顯著抑制氣管收縮（P<0.05）。見表1。

2.3 甘草次酸與茶堿聯(lián)用對組胺致敏豚鼠抗哮喘作用的影響

茶堿高、中、低組均呈劑量依賴性地延長豚鼠延喘時間（P<0.05）；甘草次酸組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；中、低濃度茶堿與甘草次酸聯(lián)用時，與相同濃度茶堿組比較，可顯著延長豚鼠延喘時間（P<0.05）。見表2。

3 討論

受cAMP調控的蛋白激酶A（PKA）在氣道平滑肌中活化后可影響多種蛋白的磷酸化，包括可抑制肌球蛋白輕鏈激酶，從而抑制肌動蛋白與肌球蛋白偶聯(lián)，使氣道平滑肌松弛；PKA活化還可促進鈣激活鉀通道，鉀離子外流導致氣道平滑肌細胞膜超極化，抵消跨壁張力引起的膜去極化及平滑肌收縮；PKA活化也抑制磷脂酰肌醇水解，從而降低細胞內游離Ca2+，阻斷依賴Ca2+的氣道平滑肌收縮反應[9]。

當PDE被抑制時，細胞內cAMP顯著升高，進而使氣道舒張。茶堿作為一種非特異性的PDE抑制劑可抑制其活性，使cAMP水平及cAMP/cGMP比值升高，抑制細胞Ca2+內流，促進Ca2+外排，降低細胞內Ca2+水平，從而擴張支氣管平滑肌[10]。因此，藥物作用后cAMP水平可直接代表藥物活性水平。

本實驗結果表明，在細胞水平，甘草次酸和茶堿聯(lián)合使用時，其胞內cAMP累計效果優(yōu)于單獨使用相同濃度茶堿；豚鼠離體氣管收縮實驗和豚鼠磷酸組胺引喘活體實驗表明，甘草次酸與茶堿聯(lián)用均可顯著增強茶堿的平喘效果。

綜上，甘草次酸與茶堿聯(lián)合使用，可有效升高茶堿平喘活性，進而降低茶堿的使用量。盡管二者聯(lián)用可降低茶堿的使用量，但其具體的協(xié)同增效機制目前尚不清晰，有待后續(xù)進一步深入研究。

參考文獻：

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