王韋崗, 強 敏, 端禮欽

(1. 鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心, 江蘇 鎮(zhèn)江 212132; 2. 徐州市農(nóng)水畜禽產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心, 江蘇 徐州 221006)

真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物,廣泛存在于糧食和飼料中。目前已知的真菌毒素有400多種,其中對人類健康影響較大的有黃曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等[1,2],超過一定攝入量后會損壞人的肝功能、致癌、致畸并誘發(fā)免疫抑制性疾病[3]。世界衛(wèi)生組織已將真菌毒素納入食品安全體系重點監(jiān)測對象[4],我國GB 2761-2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》也對上述幾種真菌毒素在食品中的限量指標有嚴格的規(guī)定。隨著食品中真菌毒素風險評估工作的不斷深入,其限量指標也將進一步完善,對檢測方法的準確性和靈敏度都提出了更高要求。百奧明公司的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)[5],一些糧食在生長和貯存過程中,經(jīng)常被多種真菌毒素污染,因此,有必要建立對多種真菌毒素同時檢測的方法。

真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[6]、熒光光度法[7,8]、高效液相色譜法[9-11]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-14]等。酶聯(lián)免疫法每次只能檢測一種真菌毒素,通常用于快速篩查;熒光光度法易受基質(zhì)干擾,測定黃曲霉毒素時需要進行化學衍生;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法由于設備較為昂貴,不利于檢測方法的普及與推廣;高效液相色譜法具有選擇性好、抗干擾能力強、靈敏度高等優(yōu)點,是目前測定真菌毒素使用最為普遍的方法之一。采用高效液相色譜法測定真菌毒素時,需要從復雜的樣品基質(zhì)中分離和富集待測組分,已有的文獻報道中通常采用多功能凈化柱[15,16]、固相萃取柱[17-19]或免疫親和柱串聯(lián)[20]的方式對提取的樣品溶液進行凈化處理,但是前兩種方法受樣品基質(zhì)效應影響較大,凈化不夠徹底,容易產(chǎn)生干擾;當需要測定的真菌毒素種類較多時,免疫親和柱串聯(lián)的方式也難以適用。近些年,復合免疫親和柱成了研究的熱點[21-23],然而受到抗體種類的影響,商品化復合免疫親和柱的使用仍有一定的局限性。

本實驗有針對性地從商品化免疫親和柱中獲取所需填料,混勻并重新裝填后制成真菌毒素復合免疫親和柱,在此基礎上,建立了在線光化學衍生-高效液相色譜同時測定谷物及其制品中黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素M1(AFM1)、黃曲霉毒素M2(AFM2)、赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的檢測方法,并對實驗條件進行了優(yōu)化,該方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結果準確的特點,適用于實驗室日常分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀、2475熒光檢測器(美國Waters公司); ToxinFast光化學衍生器(由254 nm紫外燈、聚四氟乙烯反應管組成,北京華安麥科生物技術有限公司); 3-30K離心機(美國Sigma公司); CNW 12位固相萃取真空裝置、ANPEL氮氣吹干儀(上海安譜實驗科技股份有限公司); Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 材料與試劑

黃曲霉毒素總量免疫親和柱(B1、B2、G1和G2)、黃曲霉毒素M族免疫親和柱、赭曲霉毒素免疫親和柱、玉米赤霉烯酮免疫親和柱(均為0.2 mL膠/支,1 mL,美國Beacon公司);真菌毒素六合一免疫親和凈化柱(1.0 mL膠/支,6 mL,北京華安麥科生物技術有限公司);真菌毒素復合免疫親和柱(0.8 mL膠/支,6 mL,實驗室制備);乙腈、甲醇和乙酸(均為色譜純,美國Tedia公司);氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸和吐溫-20(均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司);實驗用水為Millipore超純水系統(tǒng)制備的超純水。

標準物質(zhì):黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2(均為3 mg/L,美國o2si公司);黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A和B(均為10 mg/L,美國o2si公司);玉米赤霉烯酮(50 mg/L,美國o2si公司);黃曲霉毒素M2(10 mg/L,美國Supelco公司)

1.3 測定條件

色譜柱:Venusil XBP C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相:A為甲醇,B為水(乙酸調(diào)節(jié)pH=3.0)。梯度洗脫:0～23 min, 36%A; 23～34 min, 36%A～80%A; 34～45 min, 80%A。流速:0.8 mL/min;進樣體積:20 μL;柱溫:30 ℃;熒光檢測器:激發(fā)波長320 nm,發(fā)射波長450 nm。光化學衍生系統(tǒng):光化學衍生器(254 nm紫外燈,連接于色譜柱,然后通向熒光檢測器)。

1.4 溶液的配制

磷酸鹽緩沖溶液(PBS):稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀,用900 mL水溶解,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,加水稀釋至1 L。

含1%(體積分數(shù),下同)吐溫-20的PBS:取10 mL吐溫-20,用PBS稀釋至1 L。

9種真菌毒素混合標準溶液的配制:分別準確移取一定體積真菌毒素標準溶液于棕色容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,制備成9種真菌毒素混合標準儲備溶液,密封后避光于-20 ℃冰箱中保存。其中黃曲霉毒素B1、G1和M1的質(zhì)量濃度為300 μg/L,黃曲霉毒素B2和G2的質(zhì)量濃度為30 μg/L,黃曲霉毒素M2、赭曲霉毒素A和B的質(zhì)量濃度為100 μg/L,玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度為2 mg/L。臨用前,分別準確吸取一定體積的9種真菌毒素混合標準儲備溶液,用初始流動相(甲醇:水(乙酸調(diào)節(jié)pH=3.0)=36∶64)逐級稀釋,配制成相應濃度的混合標準工作溶液。

1.5 樣品前處理

1.5.1真菌毒素復合免疫親和柱的制備

取6 mL固相萃取柱空柱管,在底部鋪上篩板,分別將黃曲霉毒素總量免疫親和柱(B1、B2、G1、G2)、黃曲霉毒素M族免疫親和柱、赭曲霉毒素免疫親和柱、玉米赤霉烯酮免疫親和柱中的填料全部轉(zhuǎn)移至空柱管中,用PBS沖洗并使填料在柱內(nèi)混合均勻,混勻后用真空泵將填料抽至近干,并用篩板將填料壓實、壓平,制成0.8 mL膠/支的真菌毒素復合免疫親和柱。若長時間不用,需重新用PBS浸潤填料,并放置于4 ℃冰箱中避光保存。

1.5.2樣品提取與凈化

稱取(5.00±0.01) g預先粉碎并充分混勻的谷物及其制品于50.0 mL聚丙烯離心管中,加入20.0 mL乙腈-水(80∶20, v/v)提取液,渦旋振蕩提取20 min,以6 000 r/min的速度離心5 min,上清液經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾后備用。

準確移取5.0 mL上清液,加入45.0 mL含1%吐溫-20的PBS,混勻。以1～2滴/s的速度將上述混勻后的溶液全部通過真菌毒素復合免疫親和柱,分別加入5.0 mL含1%吐溫-20的PBS和10.0 mL水淋洗免疫親和柱,待水滴完后,用真空泵抽干免疫親和柱。用2.0 mL甲醇以1～2滴/s的速度洗脫免疫親和柱,收集全部洗脫液至試管中。在50 ℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干,加入1.0 mL初始流動相,渦旋30 s溶解殘留物,經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾,收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

2 結果與討論

2.1 掃描波長的選擇

采用Waters 2475熒光檢測器3D(three-dimensional)掃描功能分別在波長250～400 nm和350～600 nm范圍內(nèi)對9種真菌毒素混合標準工作溶液進行掃描,測定9種真菌毒素光化學衍生產(chǎn)物的激發(fā)波長和發(fā)射波長,掃描結果見圖1。結果表明,經(jīng)光化學衍生后,黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和B的最佳激發(fā)波長分別為355、355、362.5、355、362.5、355、310、332.5和310 nm;最佳發(fā)射波長分別為412.5、412.5、437.5、412.5、450、412.5、450、450和450 nm。綜合考慮后選擇激發(fā)波長320 nm、發(fā)射波長450 nm作為掃描波長,此時9種真菌毒素均具有較高的響應值。

圖 1 9種真菌毒素光化學衍生后的激發(fā)和發(fā)射光譜圖

2.2 流動相條件的選擇

分別以乙腈-水、甲醇-水和甲醇-水-乙酸作為流動相,考察了不同流動相條件對9種真菌毒素峰形及分離情況的影響。以乙腈-水為流動相時,由于乙腈的洗脫能力較強,各組分之間不能完全分離;以甲醇-水為流動相時,通過調(diào)節(jié)流動相之間的比例能夠使9種真菌毒素實現(xiàn)基線分離。然而,在此流動相條件下赭曲霉毒素B的響應較低,峰變寬,峰形較差,難以滿足赭曲霉毒素B殘留的檢測要求。進一步優(yōu)化流動相條件,發(fā)現(xiàn)往水相中加入少量乙酸溶液后,赭曲霉毒素B的響應明顯增加,展寬消失,同時赭曲霉毒素A和B的保留時間都發(fā)生了變化,而其他幾種真菌毒素的保留時間和峰形均無影響。調(diào)節(jié)水相中乙酸溶液的加入量,改變流動相的pH值,考察pH值對9種真菌毒素測定結果的影響。結果(見圖2)表明,流動相pH值對9種真菌毒素的峰形、分離度和響應值有很大影響。當pH=3.5時,赭曲霉毒素B與玉米赤霉烯酮的保留時間完全重合;隨著水相中乙酸溶液加入量的增加,流動相pH值減小,赭曲霉毒素A和B的保留時間變短,當pH=3.0時,9種真菌毒素實現(xiàn)基線分離,且峰形和響應值均能滿足檢測要求;繼續(xù)減小流動相pH值,當pH=2.8時,黃曲霉毒素的保留時間變短,響應值降低,同時赭曲霉毒素A與玉米赤霉烯酮的保留時間完全重合。因此,確定以甲醇-水作為流動相,并用乙酸調(diào)節(jié)水相pH=3.0,在此條件下對9種真菌毒素進行測定。

圖 2 流動相pH值對9種真菌毒素測定結果的影響

2.3 光化學衍生對測定結果的影響

9種真菌毒素中黃曲霉毒素B1和G1在水溶液中會發(fā)生熒光淬滅,直接測定時熒光強度較弱,因此需要采用衍生的方法增強黃曲霉毒素B1和G1的熒光強度。常用的衍生方法有:柱前三氟醋酸衍生、柱后溴衍生和柱后碘衍生[24,25]等,其衍生過程、檢測靈敏度及重現(xiàn)性易受衍生溫度、時間和衍生試劑等因素影響。本試驗利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光這一特性,采用在線光化學衍生技術,以流動相中的水作為衍生劑,對黃曲霉毒素B1和G1進行衍生化處理,使流動相中的水與黃曲霉毒素B1和G1作用,在芳烴上導入給電子基團-OH,生成熒光更強、更穩(wěn)定的化合物,從而解決了黃曲霉毒素B1和G1在水溶液中發(fā)生熒光淬滅的問題,增強了黃曲霉毒素的熒光強度[26]。圖3為光化學衍生前后9種真菌毒素混合標準工作溶液測定色譜圖。從圖中可以看出,經(jīng)光化學衍生之后黃曲霉毒素B1和G1的熒光響應強度明顯提高,其他7種真菌毒素的熒光響應影響較小。

圖 3 光化學衍生前后9種真菌毒素混合標準工作溶液的色譜圖

2.4 自制真菌毒素復合免疫親和柱性能評價

吸取1.0 mL相應濃度的9種真菌毒素混合標準工作溶液于50 mL聚丙烯離心管中,加入50.0 mL含1%吐溫-20的PBS,混勻,分別采用自制真菌毒素復合免疫親和柱、商品化的真菌毒素六合一免疫親和凈化柱按照1.5.2節(jié)的方法進行過柱、淋洗、洗脫和測定,每種免疫親和柱平行測定3次,測定結果見表1。從表中可以看出,自制復合免疫親和柱與商品化復合免疫親和柱均具有較好的回收率,回收率均大于85%,自制復合免疫親和柱的相對標準偏差(RSD)為0.7%～2.2%,略低于商品化復合免疫親和柱(RSD值為0.6%～1.7%)。結果表明,自制復合免疫親和柱的回收率和精密度能夠滿足實驗要求。

表 1 9種真菌毒素在不同免疫親和柱上的平均回收率和精密度(n=3)

表 2 方法的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

y: peak area;x, mass concentration, μg/L.

2.5 標準曲線、線性范圍及檢出限

分別準確吸取適量體積的9種真菌毒素混合標準儲備液,用初始流動相逐級稀釋成一定濃度的混合標準工作溶液,按1.3節(jié)優(yōu)化后的實驗條件進行測定,以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x, μg/L)作圖,所得回歸方程、線性范圍和相關系數(shù)(R2)如表2所示。向空白樣品中添加低濃度水平的9種真菌毒素混合標準溶液,采用自制真菌毒素復合免疫親和柱,按照1.5.2節(jié)的方法進行樣品前處理后上機檢測,以S/N=3確定檢出限(LOD),S/N=10確定定量限(LOQ)。結果(見表2)表明,采用外標峰面積法定量,9種真菌毒素在相應的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關系,相關系數(shù)(R2)大于0.999,該方法線性范圍良好,檢出限低,可滿足實際樣品的檢測。

2.6 方法的加標回收率和精密度

分別向預先粉碎并混勻的空白大米、小麥粉和玉米樣品中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的9種真菌毒素混合標準工作溶液,采用自制真菌毒素復合免疫親和柱進行樣品前處理,并按照1.3節(jié)方法進行測定,考察方法的回收率。對加標樣品重復測定6次,考察方法的精密度。結果表明,9種真菌毒素的回收率均在80%以上,RSD為1.0%～5.6%,詳細結果見表3。

表 3 大米、小麥粉和玉米中9種真菌毒素在不同加標水平下的加標回收率和精密度(n=6)

2.7 實際樣品分析

從超市隨機購買50批谷物及其制品,包含大米、小麥粉、麥片、玉米和玉米面等,采用該方法測定樣品中9種真菌毒素的殘留量。在2個麥片樣品和3個玉米制品中檢出了黃曲霉毒素B1,含量分別為0.25、0.58、0.22、0.31和0.71 μg/kg,玉米赤霉烯酮的檢出率較高,在小麥粉、玉米和玉米淀粉等9個樣品中均有檢出,含量從19.17至53.06 μg/kg不等,未超過GB 2761-2017規(guī)定的限量指標,除此之外的其他7種真菌毒素均未檢出。分別采用GB 5009.22-2016第三法和5009.209-2016第一法測定陽性樣品中的黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮[25,27],測得黃曲霉毒素B1的含量為0.24～0.73 μg/kg,玉米赤霉烯酮的含量為19.62～55.35 μg/kg。結果表明,本文建立的在線光化學衍生-高效液相色譜同時測定谷物及其制品中9種真菌毒素的方法及自制真菌毒素復合免疫親和柱能夠滿足食品安全國家標準規(guī)定要求。

3 結論

本文采用自制真菌毒素復合免疫親和柱凈化樣品,富集谷物及其制品提取液中的9種真菌毒素,并基于紫外光照射能夠增強黃曲霉毒素B1和G1的熒光強度,建立了在線光化學衍生-高效液相色譜同時測定谷物及其制品中9種真菌毒素的方法。采用本方法,可以依據(jù)真菌毒素種類選擇合適填料自制真菌毒素復合免疫親和柱,既能減少抗體的浪費,同時還能夠利用抗體抗原的特異性和高選擇性從復雜的待測樣品中提取目標化合物,避免無關待測物質(zhì)對目標化合物的干擾。該方法的各項指標能夠滿足谷物及谷物制品中9種真菌毒素檢測的要求。