張穎怡, 李 良, 邢旭琴, 周政政, 馬安德*

(1. 南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗檢疫系, 廣東 廣州 510515; 2. 中山大學中山醫(yī)學院法醫(yī)學系, 廣東 廣州 510080)

甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)屬于苯丙胺(amphetamine, AM)類興奮劑,其鹽酸鹽又名“冰毒”,有著強烈的致幻作用及成癮性,是我國管制類精神物質。從化學結構看(見圖1), METH等苯丙胺類物質的結構中含有一個不對稱的手性中心[1],具有兩個對映異構體,分別為S-(+)-METH和R-(-)-METH,其對中樞神經系統(tǒng)的作用、毒性及代謝機制均有較大差異[2],S-(+)-METH是“冰毒”的主要成分,而R-(-)-METH多用于醫(yī)療[3]。(±)-METH即為等物質的量的S-(+)-METH和R-(-)-METH混合而成。同時,AM作為METH的代謝產物,常與METH同時出現(xiàn),因此對于METH和AM手性對映異構體的區(qū)分顯得尤為重要。

圖 1 甲基苯丙胺的化學結構式

隨著新型毒品的合成方式及原料獲取趨于簡單,METH的濫用現(xiàn)象仍不斷出現(xiàn)。METH可以在多種生物檢材中被檢出,如尿液及血液,但這兩種生物檢材的檢測窗口期較短,并存在易污染、難以采集與保存的弊端[4,5]。毛發(fā)作為一個穩(wěn)定、易采集與保存的生物樣本,其檢測窗口期可以顯著延長,同時可以長時間穩(wěn)定保存毒品信息。因此,毛發(fā)中毒品的檢測也可以作為認定吸毒成癮的依據(jù)[6,7],但毛發(fā)作為固體介質,提取方法不同于血液、尿液等生物檢材[8-13]。目前已有對METH對映異構體的研究報道[14-17]。早期,METH對映異構體的分離主要依靠衍生化[16,17],但該法耗時較長且較為復雜,而采用直接法,利用手性固定相則可以簡化前處理過程[18,19]。Wang等[15]利用手性固定相與液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)對毛發(fā)中METH和AM進行了分析,但未對毛發(fā)前處理方法進行深入探討。

本實驗考察了不同前處理方法對毛發(fā)中甲基苯丙胺與苯丙胺對映異構體回收率的影響,并在此基礎上優(yōu)化了HPLC-MS/MS方法,最終用于實際司法鑒定案例的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AD XR高效液相色譜儀(日本島津公司); API 4000三重四極桿質譜儀(美國AB公司)。

S-(+)-AM、R-(-)-AM、(±)-AM、S-(+)-METH、R-(-)-METH、(±)-METH(1 mg/mL,溶于甲醇溶液,美國Cerilliant公司);鹽酸普羅地芬(proadifen hydrochloride,純度>95%)、乙酸銨(色譜純)(美國Aladdin公司); 4-苯基丁胺(純度98%,日本TCI公司);甲醇(色譜純,美國Merck公司);甲酸(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司);鹽酸、乙醚、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(廣州化學試劑廠)。實驗用水為Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)制備。所有流動相均用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2 溶液的配制

各取1 mg/mL標準品,用甲醇稀釋,配制1 μg/mL的標準儲備液,于-20 ℃冰箱保存;臨用時用甲醇稀釋,配制合適濃度的混合標準工作液;用甲醇將(±)-METH和(±)-AM標準儲備液稀釋為500 ng/mL的混合標準溶液,在制作空白毛發(fā)加標樣本時作為加標溶液使用。

1.3 毛發(fā)的清洗及研磨

采用二氯甲烷、水、丙酮各約50 mL對毛發(fā)樣品依次振蕩清洗一次,于室溫下晾干,然后采用2.5 mm鋼珠與毛發(fā)高速渦旋研磨,最后將毛發(fā)分成每份約20 mg,待檢。

1.4 樣品前處理

1.4.1酸水解法

取約20 mg經1.3節(jié)處理過的毛發(fā),加入1 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液(pH 1.0)或磷酸緩沖液(pH 5.0),于55 ℃水浴水解12 h,加入鹽酸水解12 h后,需用10%(v/v)氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值,使其大于11。水解液用3 mL乙醚提取,渦旋1 min,以13 000 r/min離心10 min,取有機層,于60 ℃水浴揮干,殘余物中加入200 μL甲醇復溶,取5 μL進樣分析。

1.4.2堿水解法

取約20 mg經1.3節(jié)處理過的毛發(fā),加入1 mL 100 g/kg氫氧化鈉溶液,于80 ℃水浴水解5 min(或60 ℃水浴水解10 min);或加入1 mL 50 g/kg氫氧化鈉溶液,于70 ℃水浴水解20 min。水解液用3 mL乙醚提取,其他操作同1.4.1節(jié)。

1.4.3甲醇高溫水浴超聲法

取約20 mg經1.3節(jié)處理過的毛發(fā),加入1 mL甲醇,于70 ℃水浴超聲30 min,以13 000 r/min離心10 min,用0.22 μm微孔濾膜過濾,氮氣吹干,殘余物中加入200 μL甲醇復溶,取5 μL進樣分析。

1.5 空白毛發(fā)的加標方式

實驗采用未吸毒人員的毛發(fā)作為空白毛發(fā)。將配制好的500 ng/mL (±)-METH和(±)-AM混合標準溶液直接加入研磨后的毛發(fā)樣品中,混勻平衡48 h后,氮氣吹干,再進行前處理。最終加標毛發(fā)樣品的加標量為100 ng/mg。

1.6 分析條件

色譜柱為SUPELCO Astec CHIROBIOTIC?V2手性液相色譜柱(250 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫為25 ℃;流動相為甲醇-含0.1%(v/v)甲酸的20 mmol/L乙酸銨水溶液(99∶1, v/v);流速為0.4 mL/min;進樣量為5 μL。

離子源為電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;檢測模式為多反應監(jiān)測模式;離子源溫度為600 ℃;電噴霧電壓為5 500 V;輔助氣1(gas 1)和輔助氣2(gas 2)壓力為379 kPa和448 kPa。目標化合物的具體質譜參數(shù)見表1。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實驗初始使用DAICEL CHIRALPAK?IA-3手性色譜柱,發(fā)現(xiàn)該色譜柱對苯丙胺類對映異構體選擇性較差,無法實現(xiàn)分離。然后采用SUPELCO Astec CHIROBIOTIC?V2手性色譜柱,該色譜柱的填料含有萬古霉素,對胺類化合物立體選擇性較好,故選為實驗所用。

表 1 S-(+)-AM、R-(-)-AM、S-(+)-METH、R-(-)-METH的 保留時間和質譜參數(shù)

DP: declustering potential; CE: collision energy; * quantitative ion.

本實驗考察采用不同有機相和水相時目標化合物的分離效果(見圖2)。使用乙腈作為有機相、含0.2%(v/v)冰醋酸的0.05%(v/v)氨水作為水相時,METH和AM的手性對映異構體始終無法分離(顯示為單峰),而將有機相更換為甲醇時,METH與AM的手性對映異構體可實現(xiàn)初步分離,且甲醇對目標化合物具有更好的分離選擇性,因此將甲醇確定為有機相。開始使用一元流動相,向甲醇內添加不同的酸、堿溶液,并嘗試改變甲醇內添加劑的類型和比例,但均未能獲得較好分離。然后改用二元流動相進行分離,并比較了0.05%(v/v)氨水(含0.2%(v/v)冰醋酸)與20 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)作為水相時的分離效果,發(fā)現(xiàn)使用后者時METH與AM的手性對映異構體分離效果較為穩(wěn)定(分離度分別為1.52和1.61),峰形較好,響應高,而在前面兩種流動相下,METH和AM的手性對映異構體分離不穩(wěn)定且峰形較差(分離度分別為0.98和1.12)。

確定了有機相與水相后,對兩相的比例進行了考察。研究發(fā)現(xiàn),隨著水相比例的提高,出峰時間逐漸縮短,但分離效果變差,因此實驗最終確定有機相和水相的體積比為99∶1。該方法在12 min內實現(xiàn)METH和AM對映異構體的手性分離。

圖 2 采用不同流動相時目標化合物的總離子色譜圖

圖 3 不同內標與(±)-METH(100 μg/L)的總離子色譜圖

2.2 內標的選擇

本實驗考察了4-苯基丁胺和鹽酸普羅地芬兩種物質作為內標時的效果(見圖3)。4-苯基丁胺常作為研究苯丙胺類物質時的內標,但在本實驗條件下4-苯基丁胺的峰形不佳,且因其離子對(m/z150.1/91.0)與甲基苯丙胺的離子對(m/z150.1/91.1)互相影響,在該條件下色譜圖出現(xiàn)了多重峰,為4-苯基丁胺與(±)-甲基苯丙胺合并的峰(見圖3a),且經多次調整仍無法分離,并不適合本方法。

實驗考察的鹽酸普羅地芬常作為毒藥物研究時的內標,由圖3b可知,鹽酸普羅地芬在該條件下峰形良好,始終能夠保持尖銳的峰,保留時間穩(wěn)定,且與甲基苯丙胺一同考察時可實現(xiàn)分離,因此本實驗選用鹽酸普羅地芬作為內標物質。

圖 4 不同提取方法下(±)-METH、(±)-AM和內標的總離子流色譜圖

2.3 提取方法的考察

苯丙胺類物質可通過多種途徑進入毛發(fā)。因此,為能夠最大限度地提取毛發(fā)中的毒物,同時減少損耗并不破壞對映異構體的結構,提取方法顯得尤為重要。本實驗采用酸水解、堿水解及甲醇高溫水浴超聲法對加標樣品中不同構型的化合物進行定量,并通過計算加標回收率和考察對映異構體的峰形衡量不同前處理方法的優(yōu)劣。

由圖4可知,鹽酸普羅地芬和AM在各提取方法中峰形相對穩(wěn)定,但是METH受提取方法的影響較大。其中,采用酸水解法和甲醇高溫水浴超聲法時(±)-甲基苯丙胺的峰形較好,拖尾因子>0.95。然而,在進行堿水解后,(±)-甲基苯丙胺的峰形較差,與其他方法差異較大,可能原因是在該條件下METH手性結構被破壞;部分已與水解液發(fā)生反應或在水解過程中被消解。

實驗采用的空白毛發(fā)為未吸毒人員的毛發(fā),無背景值(低于檢出限)。由圖5可知,采用甲醇高溫水浴超聲法時(±)-甲基苯丙胺和(±)-苯丙胺的加標回收率最好,該法也是耗時最短、操作最為便捷的提取方法。實驗還對比了常溫超聲與高溫超聲提取的提取效果。結果表明,如要達到相同的提取率,常溫提取至少需要超聲1 h,耗時較長,效率較低。隨著超聲溫度的升高,提取效率也得到提高,但當水浴溫度超過70 ℃或者溫度大于50 ℃、超聲時間超過30 min,甲醇會較快發(fā)生沸騰,且較為劇烈,并發(fā)生溢出現(xiàn)象,因此水浴溫度設為70 ℃。

圖 5 不同提取方法下目標化合物的加標回收率

2.4 方法學評價

2.4.1標準曲線、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)

對加標的空白毛發(fā)進行分析,以苯丙胺類化合物的峰面積(y)對其含量(x, ng/mg)進行線性回歸,結果表明,4種物質在15～300 ng/mg線性范圍內線性關系良好(見表2)。

表 2 目標化合物的線性方程、相關系數(shù)(r)、檢出限和定量限

y: peak area;x: content, ng/mg.

本方法對信噪比(S/N)進行計算得出檢出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)。結果表明,R-(-)-甲基苯丙胺、S-(+)-甲基苯丙胺的LOD為0.1 ng/mg,R-(-)-苯丙胺和S-(+)-苯丙胺的LOD為0.15 ng/mg;R-(-)-甲基苯丙胺、S-(+)-甲基苯丙胺的LOQ為0.4 ng/mg,R-(-)-苯丙胺和S-(+)-苯丙胺的LOQ為0.5 ng/mg,滿足檢測需要。

2.4.2精密度

為保證數(shù)據(jù)的可靠性,配制低、中、高3個水平(20、100、250 ng/mg)的質量控制(QC)樣品,每個水平進行6次平行樣本分析,根據(jù)當批的標準曲線,計算QC樣品的含量。結果表明,各化合物含量的日內精密度≤6.8%,日間精密度≤11.4%(見表3)。

表 3 4種目標化合物的日內和日間精密度(n=6)

2.5 實際樣品檢測

對50余例甲基苯丙胺濫用者的毛發(fā)進行了編號及檢測,其中有35例(70%)同時檢出單一的S-(+)-甲基苯丙胺和S-(+)-苯丙胺,其中1號(No.1)樣品的檢測結果見圖6a。剩余15例同時檢出了S-(+)-甲基苯丙胺、S-(+)-苯丙胺和R-(-)-甲基苯丙胺,其中9例(18%)同時檢出了S-(+)-苯丙胺和R-(-)-苯丙胺,但均以S構型為主(見表4),其中26號(No.26)樣品的總離子色譜圖見圖6b。

收集的50例陽性樣本均確診為甲基苯丙胺濫用者,且毛發(fā)作為能夠長時間穩(wěn)定保存其內在毒物的生物檢材,所提供的生物信息反映的時間跨度更長。其中,AM作為METH的代謝產物,與METH同時檢出,構型一致,說明該法檢測靈敏準確。而其中同時檢出兩個構型METH的樣本,檢出相應構型AM的占18%,這也與代謝規(guī)律一致。而15例中未檢出R-(-)-苯丙胺的樣本,考慮其R構型在代謝和檢測時可能存在損失或含量低于檢出限。由此可見,濫用者吸食“冰毒”的主要構型仍為S-(+)-甲基苯丙胺,這一點也與相關報道[3,15]一致。同時,這個結果也為打擊制毒犯罪提供更明確的方向。

圖 6 (a)1號和(b)26號陽性樣本的總離子色譜圖

表 4 15例檢出S-(+)-METH和R-(-)-METH的陽性樣本中各構型的比例

ND: not detected.

3 結論

本次實驗對比了不同提取方法對毛發(fā)中METH及AM手性對映異構體的影響,同時對HPLC-MS/MS條件進行優(yōu)化,建立了METH和AM對映異構體的手性分離方法。該法具有簡便經濟、效率高與靈敏度高等優(yōu)點。通過應用于司法鑒定實際案例,說明該法在實際應用中具備可行性,并確定了濫用者吸食METH的主體構型,為法醫(yī)毒物鑒定提供技術支持,同時也為毒物對映異構體手性分離、毒物管制等方面給予一定參考。