唐維英, 黃澤瑋, 錢廣生, 魏宇濤, 黃 瑛, 徐小平, 余曉琴*

(1. 四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院, 四川 成都 610097; 2. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院, 四川 成都 610041)

非法添加是指使用食品添加劑以外的任何化學(xué)物質(zhì)和可能危害人體健康的物質(zhì)[1],其中非法添加的具有解熱鎮(zhèn)痛效果的化合物主要有糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥、抗組胺藥和抗生素[2]等化合物,這些藥物通過各種途徑產(chǎn)生解熱鎮(zhèn)痛的效果[3]。近年來,隨著國家食品藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)加大力度對保健品的監(jiān)督檢查,不法商家開始將非法添加轉(zhuǎn)至普通食品中,其形式多樣、檢測分析難度大,如近年來發(fā)現(xiàn)的配制酒中添加壯陽類化合物,咖啡中添加減肥類化合物等[4],同時添加的形式和手段也由過去單一的較大量添加變成混和的較少量添加,或添加某種藥物的先導(dǎo)化合物或者改造物[5],單一的某種藥物不足以對人體造成傷害,但多種相同效果的藥物同時作用會對人體造成相同甚至更嚴(yán)重的傷害[6]。由于缺乏快速有效的檢測方法,食品中非法添加化合物的檢測面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

國內(nèi)關(guān)于解熱鎮(zhèn)痛效果化合物的檢測,前期的主要依據(jù)是補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《抗風(fēng)濕類中成藥補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2009025》,其主要針對中成藥,能檢測的化合物僅有13個,需要分幾個檢測系統(tǒng)分別進(jìn)行定性和定量檢測,分析方法繁瑣、效率低、檢測種類有限。因此,研究出一種應(yīng)用范圍更廣、檢測化合物更多、更易操作的關(guān)于食品中非法添加的具有解熱鎮(zhèn)痛效果化合物的檢測方法尤為重要。目前非法添加檢測的手段主要有薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8,9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-15]、液相色譜-核磁聯(lián)用法[16]等。其中超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法最為普遍,該方法可實(shí)現(xiàn)同時定性定量,高靈敏度檢測,并且適用性強(qiáng),適于推廣。

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,以茶葉、代用茶和飲料作為基質(zhì),建立了一種快速、有效檢測食品中63種非法添加化合物的分析方法,為以后食品中非法添加化合物的分析測定奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀和Agilent 6460四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司); XS105電子分析天平(瑞士Mettler公司); AS20500B超聲清洗機(jī)(天津Auto science公司); MS3 digital渦旋儀(德國IKA公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

曲安西龍(triamcinolone)、潑尼松龍(predni-solone)、氫化可的松(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氟米松(flumethasone)、倍氯米松(beclomethasone)、氫化可的松醋酸酯(hydrocortisone acetate)、地夫可特(deflazacort)、甲基潑尼松龍醋酸酯(methylprednisolone acetate)、曲安奈德醋酸酯(triamcinolone acetonide acetate)、倍他米松戊酸酯(betamethasone valerate)、哈西奈德(halcinonide)、安西奈德(amcinonide)、美洛昔康(meloxicam)、雙氯芬酸鈉(diclofenac)、對乙酰氨基酚(paracetamol)、保泰松(phenylbutazone)、吡羅昔康(piroxicam)、甲氧芐啶(trimethoprim)、氨基比林(aminophenazone)、地西泮(diazapam)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、羅通定(rotundine)、舒林酸(sulindac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、安替比林(antipyrine)、異丙安替比林(propyphenazone)、非那西丁(phenacetin)、萘丁美酮(nabumetone)、苯海拉明(diphenhydramine)、磺胺甲惡唑(sulfametho-xazole)購自中國食品藥品檢定研究院,甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、曲安西龍雙醋酸酯(triamcinolone diacetate)、氟氫縮松(flurandrenolide)、潑尼松龍醋酸酯(prednisolone acetate)、氟米龍(fluoromethalone)、倍他米松醋酸酯(betamethasone acetate)、地塞米松醋酸酯(dexamethasone acetate)、布地奈德(budesonide)、氫化可的松丁酸酯(hydrocortisone butyrate)、氟米龍醋酸酯(fluorometholone acetate)、氫化可的松戊酸酯(hydrocortisone valerate)、氟輕松醋酸酯(fluocinonide)、二氟拉松雙醋酸酯(diflurasone diacetate)、潑尼卡酯(prednicarbate)、阿氯米松雙丙酸酯(alclomethasone dipropionate)、莫米他松糠酸酯(mometasone furoate)、倍氯米松雙丙酸酯(beclometasone dipropionate)購自美國藥典委員會,可的松(cortisone)、氟氫可的松醋酸酯(fludrocortisone acetate)、潑尼松醋酸酯(prednisone acetate)、依托考昔(etoricoxib)購自加拿大Toronto Research Chemicals公司,可的松醋酸酯(cortisone acetate)、曲安奈德(tramcinolone acetonide)、氯倍他索丙酸酯(clobetasol propionate)、倍他米松雙丙酸酯(betamethasone dipropionate)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,氟替卡松丙酸酯(fluticasone propionate)、塞來昔布(celecoxib)、氯倍他松丁酸酯(clobetasone butyrate)購自European Pharmacopoeia Reference Standard公司,以上化合物純度均大于97%。甲醇、乙腈和乙酸銨(色譜純,美國Fisher Scientific公司);甲酸銨(色譜級,美國Fisher Scientific公司),甲酸(色譜級,德國CNW公司)。所用水均為Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。樣品均購自網(wǎng)絡(luò)。

1.2 對照溶液的配制

分別精密稱取上述對照品各10 mg,以甲醇溶解,在10 mL容量瓶中以甲醇定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的對照儲備液。分別精密移取安替比林、羅通定、氨基比林、保泰松、吡羅昔康、美洛昔康、苯海拉明、非那西丁、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、氯苯那敏、依托考昔、異丙安替比林、布地奈德、倍氯米松雙丙酸酯、倍他米松雙丙酸酯、潑尼卡酯、氟米龍醋酸酯、倍他米松戊酸酯、甲基潑尼松龍、曲安西龍雙醋酸酯、曲安奈德、氯倍他索丙酸酯、曲安奈德醋酸酯對照儲備液10 μL;舒林酸、對乙酰氨基酚、氟輕松醋酸酯、二氟拉松雙醋酸酯、氟替卡松丙酸酯、阿氯米松雙丙酸酯、地西泮、潑尼松龍醋酸酯、氫化可的松丁酸酯、安西奈德、莫米他松糠酸酯、氯倍他松丁酸酯、潑尼松龍、可的松、倍他米松、地塞米松、氫化可的松戊酸酯對照儲備液25 μL,氫化可的松、潑尼松、氟米松、倍氯米松、酮洛芬、氟米龍、地夫可特、氫化可的松醋酸酯、甲基潑尼松龍醋酸酯、潑尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯、甲芬那酸對照儲備液50 μL,曲安西龍、氟氫縮松、氟氫可的松醋酸酯、哈西奈德、芬布芬、萘丁美酮、塞來昔布、雙氯芬酸對照儲備液250 μL,置于同一50 mL容量瓶中,以甲醇定容,配制成混合對照中間液。置于-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?數(shù)據(jù)采集時用甲醇稀釋至相應(yīng)的濃度。

1.3 樣品的制備

精密稱取研磨后混勻的代用茶、茶葉或搖勻的液體飲料1 g,置于50 mL量瓶中,加入甲醇約40 mL,渦旋2 min,超聲30 min,放冷至室溫,用甲醇定容至刻度,搖勻,過微孔濾膜(0.22 μm,尼龍膜),取濾液,供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.4 色譜條件

色譜柱:Thermo Acclaim RSLC C18(100 mm×2.1 mm, 2.2 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:2 μL;流動相:A為5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸), B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序:0～1 min, 5%B; 1～17 min, 5%B～37%B; 17～27 min, 37%B～85%B; 27～28 min, 85%B～95%B; 28～31 min, 95%B; 31～33 min, 95%B～5%B; 33～36 min, 5%B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:ESI;檢測方式:動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dMRM);電離電壓:4.0 kv(正離子掃描);干燥氣流速:7 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;鞘氣流速:11 L/min;鞘氣溫度:350 ℃;霧化器流量:276 kPa?；衔锒ㄐ?、定量離子及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 63種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

Product ion 2: quantitative ion. CE: collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

研究考察了Thermo Accucore XL C18(100 mm×2.1 mm, 4 μm)、Thermo Acclaim RSLC C18(100 mm×2.1 mm, 2.2 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)3款色譜柱對待測化合物的分離效果。比較了0.1%乙酸-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%乙酸)-0.1%乙酸乙腈和5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸乙腈3種流動相對分離效果的影響,并進(jìn)行了梯度優(yōu)化。結(jié)果表明,采用2.2 μm Thermo Acclaim RSLC C18柱,以5 mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸乙腈進(jìn)行梯度洗脫時,63種化合物的響應(yīng)值和峰形均較好,包括同分異構(gòu)體倍他米松和地塞米松在內(nèi)的63種化合物均可獲得較好的分離。

在ESI+模式下對0.3 μg/L的63種化合物混合對照溶液進(jìn)行質(zhì)譜掃描分析,得到每種化合物的分子離子峰[M+H]+,以分子離子峰為母離子,對其進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,優(yōu)化每種化合物母離子和子離子所需的毛細(xì)管出口電壓和碰撞能量,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。63種化合物在優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件下分離效果較好,靈敏度較高,63種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.3 μg/L)的總離子流色譜圖見圖1。

圖 1 63種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.3 μg/L)的總離子流色譜圖

2.2 前處理方法的優(yōu)化

在前期研究中,最先嘗試有機(jī)試劑超聲提取的方法,但發(fā)現(xiàn)出峰時間靠前的甲氧芐啶、對乙酰氨基酚、氨基比林等化合物的回收率偏低(20%～40%),為解決這些化合物回收率偏低的問題,將梯度放緩,采集時間延長至35 min,緩解了63種化合物與基質(zhì)共流出的問題,從而使保留時間靠前的化合物的回收率有明顯改善?？疾炝思状肌⒁译?、50%甲醇和80%甲醇的提取效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種溶劑提取后,各化合物的回收率無顯著差異,且甲醇提取回收率更接近理論值,詳見圖2。通過對陽性樣品的提取比較,結(jié)果無明顯差異?？紤]操作方便、成本、環(huán)保和對實(shí)驗(yàn)人員的健康影響(乙腈毒性比甲醇大)等因素,選擇甲醇作為提取溶劑。

圖 2 4種提取溶劑對目標(biāo)化合物回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價

研究主要針對飲料、茶葉及相關(guān)制品類成分復(fù)雜的食品,該類產(chǎn)品可能存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),而基質(zhì)效應(yīng)(ME)主要是由于樣品在離子化時基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物相互競爭電離所致,包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。采用ME=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%的計算方法對63種化合物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價。一般來說,當(dāng)ME在80%～120%之間時,表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯,在實(shí)際檢測中可忽略不計;反之則應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響,在實(shí)際檢測中應(yīng)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。由表2可知,各基質(zhì)中ME在80%～120%之間的化合物所占比例為:茶葉56%(35/63)、代用茶59%(37/63)、飲料79%(50/63),說明茶葉和代用茶基質(zhì)效應(yīng)更為明顯;部分化合物檢測會受到基質(zhì)效應(yīng)的影響。為了能更準(zhǔn)確地測定目標(biāo)化合物,本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

在GB 5009.1-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品理化檢驗(yàn)方法總則》征求意見稿中,定量限定義為樣品中被測物能被定量測定的最低限,其測定結(jié)果應(yīng)滿足該最低量時準(zhǔn)確度和精密度要求。在保證準(zhǔn)確定性的前提下,通過使用空白基質(zhì)逐級稀釋對照品溶液來考察定量限,最終在保證線性良好、精密度<15%、絕大部分化合物回收率在80%～120%的前提下,63個化合物的定量限為0.10～2.50 mg/kg,詳見表2。

配制63種化合物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用空白樣品基質(zhì)提取液配制系列基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在已優(yōu)化的色譜與質(zhì)譜條件下,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以峰面積(y)與相對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x, μg/L)作圖,并計算各待測物線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),63種化合物的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上,具體線性關(guān)系參數(shù)見表2。

表 2 63種化合物在純?nèi)軇┖?種不同基質(zhì)中的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)和定量限

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.4.2準(zhǔn)確度、重復(fù)性和進(jìn)樣精密度

以3種食品基質(zhì)飲料、茶葉及代用茶作為代表基質(zhì),進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。按照定量限的1、2、5倍進(jìn)行添加水平試驗(yàn),各水平制樣6份。以測出量對理論添加量的百分比值計算平均回收率;每水平進(jìn)行了6次平行實(shí)驗(yàn),以測出量的RSD表示方法重復(fù)性;取2倍定量限水平的樣品連續(xù)進(jìn)樣6針,以測出量的RSD表示進(jìn)樣精密度。由表3可知,63種化合物各添加水平平均回收率為62.4%～129.4%,重復(fù)性、進(jìn)樣精密度的RSD值為0.3%～9.6%,方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性和精密度均基本滿足定量分析的要求。

表 3 3種基質(zhì)中63種化合物的回收率、進(jìn)樣精密度和重復(fù)性(n=6)

表 3 (續(xù))

表 3 (續(xù))

表 3 (續(xù))

2.4.3穩(wěn)定性

分別配制茶葉、代用茶和飲料3種基質(zhì)的低水平加標(biāo)溶液1份,放置0、1、2、4、8、12和24 h后分別進(jìn)行測定,以峰面積計算63種化合物在3種基質(zhì)中0～12 h和0～24 h的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD,在12 h內(nèi),3種基質(zhì)中63種化合物的RSD均<15%; 24 h時涼茶飲料基質(zhì)中部分化合物(5/63)的RSD普遍增高(≥20%)。結(jié)果說明,在12 h內(nèi),3種基質(zhì)供試品溶液的穩(wěn)定性滿足定量分析的要求。

2.4.4實(shí)際樣品的測定

利用建立的方法,對網(wǎng)上宣稱具有解熱鎮(zhèn)痛作用的83批代用茶和涼茶飲料進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)陽性樣品8批次,詳細(xì)結(jié)果見表4。

表 4 實(shí)際樣品測定結(jié)果

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3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測茶葉、代用茶和飲料中63種化合物的分析方法。該方法樣品前處理簡單,分析速度快,靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,能滿足同時測定食品中63種化合物的要求。該方法已經(jīng)被國家食品藥品監(jiān)督管理總局收錄為補(bǔ)充檢驗(yàn)方法,有望在食品非法添加物的檢測中發(fā)揮重要作用。