鄭小嚴(yán)

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院, 福建 福州 350002)

乙撐硫脲(ethylenethiourea,簡(jiǎn)稱(chēng)ETU)是代森類(lèi)殺菌劑(ethylenebisdithioearbomates,簡(jiǎn)稱(chēng)EBDCs)的共同降解產(chǎn)物及其產(chǎn)品的雜質(zhì)。ETU具有慢性毒性,對(duì)哺乳動(dòng)物具有致癌性、致突變性及致畸性。雖然ETU在農(nóng)作物和農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量相對(duì)較低,但不少研究表明,殘留在農(nóng)產(chǎn)品中的EBDCs可在農(nóng)產(chǎn)品的加工、烹飪等過(guò)程中轉(zhuǎn)化為ETU,從而帶來(lái)危害[1]。代森錳鋅因其具有高效、廣譜等優(yōu)點(diǎn)而在農(nóng)作物病蟲(chóng)防治過(guò)程中廣為應(yīng)用,如在茶葉種植中用于防治赤星病[2],但有關(guān)研究[3]顯示,長(zhǎng)期暴露于代森錳鋅可能與帕金森等精神退化性疾病相關(guān)。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中食品農(nóng)藥的最大殘留量》[4]中代森錳鋅的每日最大允許攝入量(ADI)為0.03 mg/kg BW,但對(duì)乙撐硫脲的殘留限量還沒(méi)有規(guī)定;葉孟亮等[5]研究了我國(guó)蘋(píng)果中乙撐硫脲的殘留水平并進(jìn)行了膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,最后建議將中國(guó)蘋(píng)果中乙撐硫脲最大殘留限量值設(shè)為0.2 mg/kg。因此對(duì)食物中代森錳鋅及其代謝物乙撐硫脲的檢測(cè)顯得很有必要。

關(guān)于乙撐硫脲的殘留分析方法已有很多研究報(bào)道。目前,ETU的相關(guān)檢測(cè)方法主要有GC、GC-MS、HPLC和HPLC-MS/MS法等多種。但由于ETU具有很強(qiáng)的極性,很難用GC直接測(cè)定其殘留量,通常是先將其用氯化芐轉(zhuǎn)化為低沸點(diǎn)的S-芐基ETU,再用帶氮磷檢測(cè)器(NPD)的氣相色譜儀[6-8]或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[9]進(jìn)行測(cè)定,其操作程序非常復(fù)雜,衍生不完全帶來(lái)的誤差大。采用液相色譜法檢測(cè)[10-14]時(shí),由于極性大、出峰快,經(jīng)常存在較大的干擾,需要復(fù)雜的凈化方法[10],并且紫外檢測(cè)器的靈敏度也不夠理想。此外,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15,16]檢測(cè)時(shí),茶葉等復(fù)雜樣品基體存在嚴(yán)重的離子抑制作用,大大降低了檢測(cè)的靈敏度;Lindh等[17]采用五氟芐基溴柱前衍生-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)人尿液中的ETU殘留,該方法大大提高了檢測(cè)的靈敏度,但其衍生及提取操作較復(fù)雜。本研究針對(duì)現(xiàn)有乙撐硫脲檢測(cè)方法的缺點(diǎn),采用9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC-CL)為衍生劑,對(duì)衍生條件、提取方法和檢測(cè)條件等進(jìn)行了深入的探討與研究,建立了柱前衍生-超高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)茶葉中乙撐硫脲殘留的方法。該方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏,可以更高效地滿(mǎn)足茶葉中乙撐硫脲的檢測(cè)需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜Waters Acquity UPLC系統(tǒng)配Quattro Premier XE四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)沃特世公司);冷凍高速離心機(jī)(Avanti J-E,美國(guó)貝克曼公司);渦旋混合儀(美國(guó)熱電公司);分析天平(BSA224S,賽多利斯北京有限公司); Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);超聲波清洗器(KQ-800KDE,昆山市超聲儀器有限公司);聚四氟乙烯(PTFE)一次性過(guò)濾頭(0.2 μm,美國(guó)熱電公司)。

乙撐硫脲標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);乙撐硫脲-D4同位素內(nèi)標(biāo)(純度99.3%,加拿大CDN Isotopes公司); 9-芴基甲基氯甲酸酯(色譜純,純度≥ 97.0%,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);乙腈(色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司);石墨化碳黑(GCB,美國(guó)安捷倫公司);無(wú)水硫酸鎂(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q超純水純化系統(tǒng)制備的超純水。

1.2 試劑的配制

衍生劑配制:稱(chēng)取1.0 g FMOC-CL,用乙腈溶解,定容到10 mL,配成100 g/L溶液。

QuEChERS基質(zhì)分散固相萃取凈化管:稱(chēng)取50 mg GCB和500 mg無(wú)水硫酸鎂于2 mL子彈頭離心管中備用。

乙撐硫脲及乙撐硫脲-D4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制:分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量乙撐硫脲及乙撐硫脲-D4標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解配制成約500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

乙撐硫脲及乙撐硫脲-D4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制:分別準(zhǔn)確移取代乙撐硫脲及乙撐硫脲-D4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mL,用乙腈定容到50 mL,配制成10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

乙撐硫脲標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制:準(zhǔn)確移取適量乙撐硫脲標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,配成乙撐硫脲質(zhì)量濃度為1～200 μg/L、乙撐硫脲-D4質(zhì)量濃度均為100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g粉碎均勻的茶葉樣品,加入10.0 mL乙腈和100 μL 10.0 mg/L的乙撐硫脲-D4內(nèi)標(biāo)溶液,振搖混勻,超聲提取30 min,搖勻,4 ℃、10 000 r/min下高速離心3 min;吸取1.5 mL上清液注入QuEChERS凈化管中,振搖1 min混勻,16 000 r/min下高速離心3 min;準(zhǔn)確移取上清液1.0 mL于5 mL刻度試管中,加入200 μL 100 g/L FMOC-CL乙腈溶液,立刻渦旋混勻,避光靜置60 min,過(guò)0.2 μm PTFE濾膜,6 h內(nèi)檢測(cè)。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

1.4.1超高效液相色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.3 mL/min;流動(dòng)相:A為0.1%(v/v)甲酸溶液,B為乙腈。洗脫梯度：0～6.0 min, 40%A～20%A; 6.0～6.1 min, 20%A～5%A; 6.1～8.0 min, 5%A; 8.0～8.1 min, 5%A～40%A; 8.1～10.0 min, 40%A。

1.4.2質(zhì)譜條件

電離源:大氣壓電噴霧離子源正離子模式;毛細(xì)管電壓:3.50 kV;源溫度:120 ℃;脫溶劑氣溫度:400 ℃;脫溶劑氣流量:700 L/h;錐孔反吹氣流量:50 L/h;碰撞室壓力:0.27 Pa;電子倍增管電壓:650 V;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;特征離子等參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 乙撐硫脲及其同位素內(nèi)標(biāo)的9-芴基甲基氯甲酸酯衍生物的質(zhì)譜參數(shù)

Parent ion: [M+H]+; * quantitative ion.

圖 1 乙撐硫脲衍生物和乙撐硫脲-D4衍生物的質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取約1 mg/L的乙撐硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL,加入200 μL衍生劑衍生。將衍生后的標(biāo)準(zhǔn)溶液由進(jìn)樣器進(jìn)樣,經(jīng)色譜柱分離后采用MS-Scan模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,在ESI(+)模式下找到乙撐硫脲二取代衍生物準(zhǔn)分子離子峰m/z547.2;再經(jīng)母離子碰撞后采用Daughter-Scan模式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描,通過(guò)優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到乙撐硫脲衍生物的子離子掃描質(zhì)譜圖,同法對(duì)乙撐硫脲-D4同位素內(nèi)標(biāo)的衍生物進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描,結(jié)果的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1,最終確定相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)，見(jiàn)1.4.2節(jié)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本方法采用了美國(guó)Waters公司的超高效液相色譜儀和1.7 μm粒徑的BEH-C18超高效液相色譜柱,具有極高的分離效率。本研究分別考察了純水/乙腈體系、0.02%(v/v)甲酸/乙腈體系、0.1%(v/v)甲酸/乙腈體系、0.3%(v/v)甲酸/乙腈體系作為流動(dòng)相的分離效果,發(fā)現(xiàn)提高流動(dòng)相酸度有利于提高離子化效率和檢測(cè)靈敏度,但酸度太大會(huì)發(fā)生色譜峰開(kāi)叉,最終發(fā)現(xiàn)在0.1%(v/v)甲酸/乙腈體系下檢測(cè)效果最佳。優(yōu)化后的色譜條件和洗脫梯度見(jiàn)1.4.1節(jié)。此時(shí),乙撐硫脲及同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后的總離子流(TIC)圖和MRM色譜圖見(jiàn)圖2。

圖 2 乙撐硫脲(5 μg/L)及ETU-D4(100 μg/L)衍生物的總離子流圖和MRM色譜圖

2.3 衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

9-芴基甲基氯甲酸酯以其反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定、反應(yīng)速度快且完全而成為一種十分理想的氨基衍生試劑,常用于氨基酸的衍生測(cè)試。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙撐硫脲的兩個(gè)氨基上的氫均會(huì)被FMOC-CL基團(tuán)取代,衍生產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量的理論值為546.0,與質(zhì)譜掃描發(fā)現(xiàn)的m/z547.2分子離子峰完全吻合,同時(shí),碰撞后產(chǎn)生m/z503.0、459.0和179.1的碎片離子,其反應(yīng)路徑見(jiàn)圖3。由于茶葉中存在大量的茶氨酸等氨基酸類(lèi)物質(zhì),這些氨基酸均會(huì)與FMOC-CL發(fā)生衍生反應(yīng),為保證衍生劑的量充足,本實(shí)驗(yàn)在1 mL提取液中加入200 μL質(zhì)量濃度為100 g/L FMOC-CL乙腈溶液進(jìn)行衍生反應(yīng)。文獻(xiàn)[18]中FMOC-CL的衍生條件通常是加入硼砂緩沖液，在偏堿性條件下反應(yīng),過(guò)量的衍生劑會(huì)與水反應(yīng)生成FMOC-OH和二酰化產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在含水較多的條件下衍生時(shí),乙撐硫脲的衍生產(chǎn)物峰面積較小并且穩(wěn)定性很差,半個(gè)小時(shí)內(nèi)就會(huì)發(fā)生50%的衰減。而在無(wú)水的條件下,即無(wú)需加入硼砂緩沖液,乙撐硫脲也能與FMOC-CL發(fā)生衍生反應(yīng),衍生產(chǎn)物的峰面積明顯大于加入緩沖液時(shí)衍生產(chǎn)物的峰面積(見(jiàn)圖4),并且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性大大提升(見(jiàn)圖5),衍生反應(yīng)在1 h左右達(dá)到平衡,6 h內(nèi)沒(méi)有明顯變化,但12 h后降解為最大值的60%左右。因此,本方法中茶葉的乙腈提取液不加緩沖液，直接衍生,并且在樣品衍生1 h后和6 h內(nèi)進(jìn)行樣品測(cè)試。造成該現(xiàn)象的原因可能是,乙撐硫脲與FMOC-CL的反應(yīng)速率遠(yuǎn)低于FMOC-CL與水反應(yīng)的速率,FMOC-CL大量與水反應(yīng)造成乙撐硫脲衍生不完全,衍生產(chǎn)物在大量水分子的存在下會(huì)極不穩(wěn)定,降解速度很快,為了維持衍生反應(yīng)體系的穩(wěn)定性,應(yīng)盡可能減少水分子的存在。由于乙撐硫脲衍生產(chǎn)物的質(zhì)量濃度會(huì)隨時(shí)間發(fā)生變化,因此,該方法必須采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。

2.4 樣品提取條件的選擇

乙撐硫脲的極性較大,水是最佳溶劑。目前,文獻(xiàn)采用的提取劑主要為甲醇-水溶液[6,7,11,14]和氨水-乙腈溶液[10,13]等,這些提取劑中都含有水。由于本研究發(fā)現(xiàn)，乙撐硫脲與FMOC-CL的衍生反應(yīng)要盡可能避免水的存在,因此采用乙腈為提取劑。乙腈對(duì)乙撐硫脲也具有良好的溶解性,同時(shí)采用超聲振蕩提取的方法可加快樣品的提取速度。表2的加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該提取方法效果良好。

圖 3 乙撐硫脲與FMOC-CL的衍生反應(yīng)及其產(chǎn)物的碰撞碎裂路徑

圖 4 兩種衍生方法下茶葉加標(biāo)提取液的質(zhì)譜結(jié)果

圖 5 茶葉加標(biāo)衍生產(chǎn)物峰面積的穩(wěn)定性

2.5 樣品凈化條件的選擇

茶葉樣品水分含量較低,但含有大量的色素,未經(jīng)凈化的樣品會(huì)造成較嚴(yán)重的離子抑制和色譜柱污染。為了去除茶葉乙腈提取液中的少量水分和大量色素,本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)單易行的QuEChERS基質(zhì)分散萃取凈化方法,使用GCB吸附色素和無(wú)水硫酸鎂吸附水分的組合方式凈化樣品提取液。比較10、20、50、100 mg GCB加200、500 mg無(wú)水硫酸鎂的配方分別凈化1.5 mL紅茶、綠茶、普洱茶及鐵觀(guān)音茶的樣品提取液。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)50 mg GCB已能完全吸附4種茶提取液中的色素,所得溶液澄清透亮;由于茶葉中水分普遍較低,200 mg和500 mg無(wú)水硫酸鎂吸附水分后的提取液衍生效果沒(méi)有明顯區(qū)別,由于無(wú)水硫酸鎂價(jià)格低廉,同時(shí)為了保證吸附水分的效果,本實(shí)驗(yàn)選擇使用500 mg無(wú)水硫酸鎂。最后確定在2 mL離心管中稱(chēng)取50 mg GCB和500 mg無(wú)水硫酸鎂,加入1.5 mL茶葉提取液振搖凈化,高速離心后取1.0 mL上清液衍生后測(cè)試。經(jīng)凈化后樣品提取液色素去除明顯,衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性達(dá)到6 h以上,4種茶葉加標(biāo)提取液的色譜

峰響應(yīng)值分別提高了2～4倍,該凈化方法操作簡(jiǎn)便,適合大批量樣品的檢測(cè)。

2.6 方法的線(xiàn)性范圍和檢出限

在1.0～203.4 μg/L內(nèi),以進(jìn)行衍生反應(yīng)的乙撐硫脲標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),以乙撐硫脲定量離子峰面積除以?xún)?nèi)標(biāo)峰面積的值與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的乘積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn),所得線(xiàn)性方程的相關(guān)系數(shù)r為0.999 3。因此,在該濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。同時(shí),用乙撐硫脲含量為10 μg/kg的茶葉加標(biāo)樣品峰高按3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算乙撐硫脲的方法檢出限為1.3 μg/kg和定量限為4.2 μg/kg。

2.7 回收率和精密度試驗(yàn)

茶葉分發(fā)酵茶(如紅茶和黑茶)、半發(fā)酵茶(如青茶,代表為鐵觀(guān)音)和不發(fā)酵或輕發(fā)酵茶(如綠茶、白茶和黃茶)。分別取不含乙撐硫脲的空白紅茶、綠茶和鐵觀(guān)音茶樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn),3個(gè)水平各做6個(gè)平行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。該方法對(duì)乙撐硫脲的回收率在97.7%～107.5%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～10.0%之間。

表 2 茶葉加標(biāo)樣的回收率和精密度(n=6)

2.8 茶葉實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)市售的13個(gè)綠茶樣品、13個(gè)紅茶樣品和10個(gè)鐵觀(guān)音茶樣品進(jìn)行檢測(cè),36個(gè)茶葉樣品均未檢出乙撐硫脲殘留。

3 結(jié)論

本文建立了茶葉中的乙撐硫脲經(jīng)FMOC-CL柱前衍生化反應(yīng)后利用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測(cè)的方法。所建立的分析方法前處理步驟簡(jiǎn)單,具有良好的線(xiàn)性關(guān)系和靈敏度,重現(xiàn)性好,定性定量準(zhǔn)確,可有效滿(mǎn)足茶葉中乙撐硫脲殘留檢測(cè)的要求,為推動(dòng)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了可靠的技術(shù)支撐。