張 蓉, 劉 鑫, 彭 媛, 劉韋華, 張立承, 代 瑩, 李莎莎, 高志賢*

(1. 中華人民共和國北京海關, 北京 100026; 2. 天津環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所, 天津 300050)

中國以歷史悠久的茶文化聞名世界,茶葉的種植與加工是我國農業(yè)生產的重要領域之一,在茶園中雜草與茶樹爭奪養(yǎng)分和生存空間,造成茶樹減產和品質下降,研究表明成年茶園秋季雜草可達94種、分屬41科81屬[1],而化學除草、生物除草、人工除草、茶園鋪草等是目前常用的幾種除雜草措施[2],其中化學除草劑以其成本低、防治效果好而成為防治雜草的主要方法。由于雜草的多樣性,針對茶園雜草的品種,選擇多種除草劑進行輪換施藥及綜合防治是較為通行的辦法[3],但也會造成除草劑在土壤、水源和農作物中的殘留。研究表明,三嗪類除草劑可能引起新生兒缺陷、患癌和內分泌干擾[4],莠去津[5]、甲草胺[6]、乙草胺[7]更被明確報道具有毒性，可干擾人類的內分泌系統(tǒng)。因此,茶葉中多種除草劑的同時檢測對保障茶葉飲用安全具有重要意義。

目前,實驗室中農藥多殘留檢測可采用氣相色譜法(GC)[8]、液相色譜法(LC)[9]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)[10,11]、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[12,13]和氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)[14,15]等,氣相色譜法和液相色譜法由于待測物必須與檢測器的選擇性相適應，很難完成多種不同化學結構農藥的同時檢測。因此色譜-質譜聯(lián)用法成為農藥多殘留檢測的主流方法。高分辨質譜通過精確的相對分子質量對目標化合物進行定性定量檢測,可降低復雜樣品基質檢測中的假陽性風險,近幾年被廣泛用于農藥多殘留分析領域中。同時,高分辨質譜的高掃描速度和靈敏度也保證了多種痕量農藥殘留在復雜基質中的同時檢出[16,17]。

經(jīng)典QuEChERS法主要應用于蔬菜、水果等含水量多、基質干擾少的基質[18,19],對于茶葉等復雜基質的前處理凈化效果較差,應用石墨化炭黑(GCB)吸附色素又會降低平面結構化合物的回收率。近年來多壁碳納米管(MWCNTs)被引入農殘檢測前處理中,并展現(xiàn)出優(yōu)異特性[20-24]。

本文以綠茶、紅茶等常見茶葉為樣品基質,采用改良的QuEChERS前處理技術凈化樣品,結合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS),建立了快速、準確檢測茶葉中95種常見除草劑殘留的定性定量分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜儀Ultimate 3000 RSLC、四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀Q Exactive Orbitrap和Xcalibur工作站(美國Thermo Scientific公司);分析天平SQP(德國Sartorius公司,感量10 mg)和XPE205DR(瑞士Mettler Toledo公司,感量0.01 mg);離心機Universal 320R(德國Hettich公司)和Sigma 1-14(德國Sartorius公司);超聲波清洗器Sonorex Digitec(德國Bandelin公司);氮吹儀DTU-2BN(日本Taitec公司);移液器(德國Eppendorf公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);旋渦混勻器MS 3 Digital(德國IKA公司)。

乙腈、甲醇、甲苯、醋酸銨(色譜純)購自美國Thermo Scientific公司;甲酸(色譜純)購自北京邁瑞達科技有限公司;冰乙酸(色譜純)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無水乙酸鈉(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司;無水硫酸鎂(分析純)購自北京化學試劑公司。95種農藥標準品購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

QuEChERS吸附劑:GCB(100～400目,德國CNW公司);N-丙基乙二胺(PSA, 40～60 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司); MWCNTs(20～40 nm,純度>90%,北京博宇高科新材料技術有限公司)。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取標準品約10 mg,用甲苯定容至10 mL,配制成單一標準儲備液,再用乙腈配制成適量濃度的混合標準溶液(具體濃度見表1),于4 ℃冰箱保存。

準確吸取混合標準溶液0.5、2.5、5.0、10.0和25.0 μL,用空白基質提取液定容至1 mL,得到相應濃度的基質匹配標準工作曲線,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

稱取粉碎后的茶葉樣品5.0 g,置于50 mL離心管中,加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈-甲苯(9∶1, v/v)溶液、1.5 g無水乙酸鈉和3.0 g無水硫酸鎂,混勻,超聲提取10 min,以6 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,轉移至含150 mg無水硫酸鎂、150 mg PSA、12.5 mg MWCNTs和12.5 mg GCB的凈化管中,劇烈振搖1 min,以10 000 r/min離心10 min,用0.2 μm針筒式過濾器過濾,待上機測定。

1.4 分析條件

色譜柱:Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm);柱溫:45 ℃;樣品室溫度:5 ℃;流動相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液(含4 mmol/L乙酸銨);流動相B: 0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液(含4 mmol/L乙酸銨);流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～8.0 min, 12%B～95%B; 8.0～9.0 min, 95%B～100%B; 9.0～11.0 min, 100%B; 11.0～11.1 min, 100%B～12%B; 11.1～14.0 min, 12%B。進樣量10 μL。

鞘氣流速:4.55 L/min (35 arb);輔助氣流速:3 L/min (10 arb);反吹氣流速:0 L/min (0 arb);噴霧電壓:3.50 kV;毛細管溫度:320 ℃;管狀透鏡電壓:50.0 V;輔助氣加熱溫度:350 ℃;運行時間:14 min;極性模式:正/負;包含模式:開。全掃描參數(shù):分辨率,70 000;自動增益控制目標離子數(shù)(AGC target), 1×106;最大離子注入時間(maximum IT), 250 ms;掃描范圍,m/z100～700。數(shù)據(jù)依賴二級質譜掃描參數(shù)(data-dependent MS2, dd-MS2):分辨率,35 000;自動增益控制目標離子數(shù),2×105;最大離子注入時間,120 ms;循環(huán)次數(shù)(loop count), 5;隔離寬度(isolation width),m/z4.0;歸一化碰撞能量(NCE), 20、40和60。95種除草劑質譜掃描的母離子信息見表1。

表 1 95種除草劑的母離子、保留時間及其在混合標準溶液中的含量

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

參考Wang等[17]的方法,優(yōu)化了液相色譜條件。在1.4節(jié)色譜條件下,95種除草劑在4～10 min內分布均勻,以保留時間較前、居中和較后的二丙烯草胺、快敵蜱、稗草畏為例,其一級全掃描色譜峰峰形對稱,有利于定量分析(見圖1)。

圖 1 (a)二丙烯草胺、(b)快敵蜱、(c)稗草畏(0.1 mg/L)的提取離子色譜圖

2.2 質譜條件的優(yōu)化

對每種除草劑的單一標準溶液進行分析，并采用全掃描和自動觸發(fā)二級質譜(Full MS/dd-MS2)模式,得到每種化合物的母離子提取離子色譜圖和二級碎裂質譜圖,選取色譜峰頂端掃描點的質量數(shù)作為母離子實際質量數(shù),選擇至少2個具有代表性的二級離子作為定性離子。

結果發(fā)現(xiàn),掃描時一些信號較低或是母離子和保留時間都相近的化合物的二級質譜信號響應較低。分析原因可能是化合物自身母離子裂解較弱,或是母離子質荷比相近的化合物相互影響了二級裂解的效果。

圖 2 3種掃描模式下非草隆(10 μg/L)的提取離子色譜圖和產物離子質譜圖

圖 3 3種掃描模式下草乃敵與異惡草松產物離子的質譜圖

為提高質譜掃描效率,將所有待測化合物的母離子精確質量數(shù)輸入包含列表(inclusion list),并將其保留時間±1.5 min區(qū)間作為掃描時間段,使質譜有針對性的掃描和裂解,從而提高化合物二級質譜信號的強度。以0.01 mg/L的非草隆為例(見圖2),其母離子(m/z165.102 24)提取離子色譜圖的信號在“不開啟包含列表(nolist)”、“開啟包含列表(list)”和“開啟包含列表并限定離子掃描時間范圍(list+rt)”3種模式下強度相當,但是采用了“l(fā)ist+rt”模式的二級質譜信號強度是“nolist”模式下的2倍,且雜峰明顯較低。

又如草乃敵與異惡草松,二者母離子的m/z接近,保留時間均為7.5 min,采用“l(fā)ist+rt”掃描方式時,二級質譜的響應信號提高了5倍(見圖3)。

實驗發(fā)現(xiàn),當目標化合物濃度較低、信號較弱時,保留時間和母離子質荷比相近的化合物會彼此干擾二級裂解,因此,通過啟用包含列表,縮小掃描范圍,可以使目標化合物在現(xiàn)有條件下得到盡可能多的數(shù)據(jù)點,并產生足夠觸發(fā)二級裂解的母離子豐度,從而得到更準確的定性定量結果,避免假陰性結果的產生。

2.3 QuEChERS前處理條件的優(yōu)化

MWCNTs是一種新型的納米材料,具有獨特的理化性能和較大的比表面積,由于MWCNTs呈管狀結構,在吸附特性上與傳統(tǒng)的GCB吸附劑具有一定的差異,本方法在AOAC 2007.01方法的基礎上考察了MWCNTs與GCB的加入對凈化效果及回收率的影響。同時，考慮到GCB對平面化合物回收率的影響,在酸化乙腈中加入了少量甲苯。為提高方法的驗證效率,設計了三因素三水平正交試驗(見表2),根據(jù)碳吸附劑的不同進行3組三水平正交實驗,在3組試驗中碳吸附劑分別為GCB、MWCNTs和GCB-MWCNTs(1∶1,質量比)。以95個農藥加標回收率在80%～120%之間的農藥個數(shù)來衡量實驗結果,3組實驗的結果基本相同,采用組合2、3、4、5、7進行前處理時,有60多種農藥具有較好的回收率;凈化后組合6、8、9的凈化液完全無色,而組合4、5、7的凈化液呈淡黃色。綜合考慮回收率、色素清除效果等因素,最終選定組合5(12.5 mg GCB、12.5 mg MWCNTs、150 mg PSA、乙腈-甲苯(9∶1, v/v))作為最終的前處理條件。由表2對比極差(R)發(fā)現(xiàn),對回收率影響的順序為甲苯比例>碳吸附劑使用量>PSA使用量,甲苯的加入降低了含有苯環(huán)等平面結構的化合物在碳吸附劑上的吸附,從而顯著提高了回收率。

實驗還對比了添加10 mL水浸潤后提取和直接提取兩種模式對凈化效果的影響。結果發(fā)現(xiàn),前者凈化后,提取液顏色明顯較后者深,但是二者的回收率沒有明顯差異。因此直接用提取液進行提取后凈化上機。

表 2 三水平正交實驗

Carbon sorbent included graphitized carbon black (GCB), multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) and GCB-MWCNTs (1∶1, mass ratio), respectively. PSA: primary secondary amine;K: the sum of results in each level;k=K/3;R=kmax-kmin.

2.4 線性范圍、回收率和精密度

為消除基質效應,本實驗采用陰性樣品基質(綠茶)提取液配制基質匹配標準溶液,并對其進行分析,以各除草劑的質量濃度(X, μg/L)和對應的峰面積(Y)繪制基質匹配標準曲線,得到的線性方程和相關系數(shù)(r)見表3。結果表明,在5～250 μg/L線性范圍內,95種除草劑線性關系良好,相關系數(shù)均大于0.99,能夠滿足分析要求。

對綠茶樣品進行3個水平添加標回收試驗,結果表明,95種除草劑平均回收率為63.3%～129.1%,相對標準偏差(RSD)為0.7%～15.2%,能夠滿足分析要求。

表 3 95種除草劑的線性方程、相關系數(shù)、加標回收率和相對標準偏差(n=6)

表 3 (續(xù))

Low, medium and high spiked levels: 50, 250 and 500 μg/kg for 2,4-DB acid, allidochlor, benoxacor, bromacil, diallate, flumiclorac-pentyl, fluridone, monalide, mo-nolinuron, monuron, nitralin, norflurazon, quinoclamine, triallate, vernolate; 20, 100 and 200 μg/kg for oryzalin; 100, 500 and 1000 μg/kg for diflufenican; 10, 50 and 100 μg/kg for the other herbicides.Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

圖 4 (a)茶葉樣品和(b)標準品中地樂酚的產物離子質譜圖

2.5 實際樣品檢測

在市場上采購綠茶10份、茉莉花茶10份、烏龍茶10份、鐵觀音10份,經(jīng)本方法進行篩查,檢出11個樣品含有地樂酚,含量為26.2～44.0 μg/kg。將實際樣品中地樂酚的二級質譜圖與標準品中地樂酚的二級質譜圖進行對比(見圖4),可以看出,實際樣品中地樂酚母離子的m/z為239.066 62,兩個主要子離子的m/z為194.045 09和207.040 37,均與標準品相應離子吻合,且質量偏差在5×10-6內。經(jīng)與《茶葉中448種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-質譜法》標準方法(GB 23200.13-2016)對比,本方法定量結果的精密度小于10%,說明該方法準確性滿足定量檢測要求。

3 結論

本方法根據(jù)茶葉基質的特點,結合多壁碳納米管，對QuEChERS前處理方法進行了改良,并依托高分辨質譜建立了常見95種除草劑的定性定量檢測方法。該方法操作簡便,節(jié)省溶劑,定性定量準確,適用于茶葉等復雜樣品基質中多種除草劑的高通量同時檢測。