趙 洋, 張 勇, 王明超, 孟 波, 應(yīng)萬(wàn)濤*, 錢(qián)小紅*

(1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 北京 100124; 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所,蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心-北京, 北京 102206)

半乳糖凝集素是一類(lèi)進(jìn)化上十分保守的可溶性凝集素蛋白質(zhì)。半乳糖凝集素含有一個(gè)或兩個(gè)長(zhǎng)約130個(gè)氨基酸的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD),對(duì)β-半乳糖苷具有特異的親和力[1,2]。迄今,已有約15種哺乳動(dòng)物的半乳糖凝集素家族蛋白質(zhì)被報(bào)道,根據(jù)CRD數(shù)目可被分為三大類(lèi):單一CRD的原型,兩個(gè)CRD的串聯(lián)重復(fù)型,以及含有一個(gè)CRD和一個(gè)膠原蛋白質(zhì)樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域的嵌合型[3]。其中,半乳糖凝集素-3(Gal-3)是嵌合型中的重要成員[4],普遍存在于動(dòng)物體內(nèi),主要通過(guò)非經(jīng)典途徑分泌產(chǎn)生[5]。在人體內(nèi),Gal-3由位于14號(hào)染色體q21-22位點(diǎn)上的LGALS3基因編碼產(chǎn)生,在N端含有一個(gè)CRD區(qū)域,能與β-半乳糖及其綴合物特異性結(jié)合[6]。據(jù)報(bào)道,人源的Gal-3能與細(xì)胞內(nèi)大量的糖蛋白相互作用,參與多種生物學(xué)過(guò)程,如細(xì)胞黏附、增殖、活化、凋亡等[7-10]。

凝集素的CRD已被廣泛應(yīng)用于糖蛋白/糖肽的富集與識(shí)別中,但目前絕大部分商業(yè)化凝集素都是植物凝集素,例如對(duì)高甘露糖具有特異親和力的伴刀豆凝集素、對(duì)N-乙酰葡萄糖氨和唾液酸具有特異親和力的麥胚凝集素、對(duì)半乳糖具有特異親和力的蓖麻凝集素等[11-15]。這些凝集素已在線(xiàn)蟲(chóng)、鼠肝、血清、尿液等復(fù)雜樣本的糖蛋白質(zhì)組富集分析中得到廣泛應(yīng)用[16,17],但至今鮮有動(dòng)物凝集素應(yīng)用于糖蛋白質(zhì)組的富集研究。因此,本研究基于人源Gal-3的CRD序列特征,在原核表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建了含有1個(gè)或4個(gè)串聯(lián)重復(fù)CRD結(jié)構(gòu)域的重組Gal-3分子,并通過(guò)生化手段對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量、純度、生物素化和糖蛋白結(jié)合特征等進(jìn)行了綜合分析。隨后,將重組的凝集素蛋白質(zhì)固定到鏈霉親和素瓊脂糖小球上,形成凝集素親和柱,應(yīng)用于糖蛋白質(zhì)組的富集分析研究中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

菌種:人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC),本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌BL21(DE3)菌株購(gòu)自中國(guó)康為世紀(jì)生物科技有限公司。PET28a-gal3c(單體)、PET28a-Gal3c(四聚體)和pBirA質(zhì)粒購(gòu)自中國(guó)華大基因股份有限公司,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基:細(xì)菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L, pH 7.4, 121 ℃, 30 min),低于55 ℃時(shí)加入抗生素,固體培養(yǎng)基加1.5%(m/m)的瓊脂粉。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液(10%(v/v)胎牛血清,60 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)。

試劑:三羥甲基甲烷、丙烯酰胺粉末、N,N-亞甲基二丙烯酰胺購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;四甲基乙二胺、十二烷基磺酸鈉購(gòu)自美國(guó)Promega公司;鎳親和純化凝膠(Ni-NTA-Agarose)購(gòu)自中國(guó)克勞寧生物科技有限公司(北京);所用無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、乙酸、乙醇、考馬斯亮藍(lán)G250、EDTA等均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)自國(guó)藥試劑公司;實(shí)驗(yàn)所用咪唑、卡那青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素等均購(gòu)自中國(guó)生工生物科技有限公司(上海);消化細(xì)胞用的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(胰酶-EDTA)消化液、細(xì)胞培養(yǎng)用的青霉素和鏈霉素雙抗混合溶液、無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清(BSA)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;牛胎球蛋白、去唾液酸的牛胎球蛋白、牛脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、馬心肌紅蛋白、核糖核酸酶B、生物素均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;生物素化的伴刀豆凝集素A、麥胚凝集素、小扁豆凝集素、雞冠珊瑚樹(shù)凝集素均購(gòu)于德國(guó)Vector公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(HRP-鏈霉親和素)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒均購(gòu)于中國(guó)康為世紀(jì)公司;蛋白膠預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、鏈霉親和素瓊脂糖小球和旋轉(zhuǎn)柱均購(gòu)于德國(guó)Thermo公司;親水色譜(HILIC)填料購(gòu)于中國(guó)博納艾杰爾公司;Cocktail蛋白酶抑制劑購(gòu)于瑞士Roche公司。

儀器:串聯(lián)質(zhì)譜Q-Exactive HF、二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)購(gòu)、Nanodrop 2000型微量紫外光度計(jì)購(gòu)于德國(guó)Thermo公司;高壓滅菌鍋購(gòu)于日本Panasonic公司;超聲波破碎儀購(gòu)于中國(guó)寧波新芝生物科技股份有限公司;伯樂(lè)電泳儀和電泳槽購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠掃描儀購(gòu)于中國(guó)惠普有限公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)于中國(guó)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;脫色搖床購(gòu)于中國(guó)冠森生物科技有限公司;-80 ℃超低溫冰箱購(gòu)于日本Sanyo公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于中國(guó)上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;臺(tái)式恒溫振蕩器購(gòu)于中國(guó)蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)人半乳糖凝集素-3的cDNA序列(Gene bank: CR542097.1)及已知的Gal3C結(jié)構(gòu),選取了其331～753位的核苷酸序列作為Gal3C的編碼序列。同時(shí),在該序列的3′端添加了一段編碼Avi-tag的核苷酸序列:GTC TGA AAC GAC ATC TTC GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA,得到全長(zhǎng)的片段。將該片段通過(guò)EcoR1和Xho1插入pET28a載體中,獲得pET28a-Gal3C表達(dá)質(zhì)粒。為了獲得Tetra-Gal3C,在各個(gè)編碼片段之間加入柔性氨基酸標(biāo)簽編碼序列GGC GGT GGT GGT GGT GGC,同時(shí)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。DNA重組片段的合成以及質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)由華大基因完成。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞之后,通過(guò)卡那霉素和氯霉素的雙重抗性篩選平板選擇共表達(dá)的BL21(DE3, Gal3C/BirA)和BL21(DE3, Tetra-Gal3C/BirA)菌株。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)及目標(biāo)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

人肝癌細(xì)胞系HepG2使用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),在37 ℃含5%(v/v)二氧化碳及95%(v/v)空氣飽和濕度溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞每24 h傳代培養(yǎng),48 h后用0.25%(m/m)胰酶-EDTA溶液消化收集細(xì)胞。

在50 mL離心管中加入5 mL含50 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基,分別接入兩種含不同質(zhì)粒的菌種進(jìn)行活化。置于搖床上,37 ℃ 200 r/min條件培養(yǎng)過(guò)夜(～12 h)?；罨蟮木N分別轉(zhuǎn)入含150 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中,置于搖床上37 ℃ 200 r/min條件培養(yǎng)約2 h,至菌溶液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值(OD600)約為0.5時(shí)為止。降溫至30 ℃,向三角瓶中加入0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和10 μg/mL的生物素,進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和生物素化。37 ℃ 160 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h后轉(zhuǎn)入離心管中,4 ℃ 6 000 r/min條件下離心5 min,棄上清并收集菌體。用PBS緩沖液洗滌菌體后提取目標(biāo)蛋白質(zhì)(Gal3C和Tetra-Gal3C)。

1.2.3目標(biāo)蛋白質(zhì)的提取和純化

加入20 mL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L pH 7.8的NaCl,含Cocktail蛋白酶抑制劑)重懸菌體,使用超聲進(jìn)行破菌。10 000 g下離心30 min,保留的上清即為全蛋白提取液?；罨疦i-NTA-Agarose柱后,將全蛋白提取液重復(fù)過(guò)柱3次,讓目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合到鎳柱上。用40 mL的洗滌緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L pH 6.0的NaCl)洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì),最后用250 mmol/L咪唑洗脫并收集目標(biāo)蛋白質(zhì)。

透析袋用水洗干凈,用透析夾夾住底部,加入高濃度咪唑洗脫下來(lái)的目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液后,用透析夾封口,置于含1 L透析液(50 mL pH 7.8的10×PBS, 400 mL水,50 mL甘油)的燒杯中,用保鮮膜封口后置于4 ℃冰箱,磁力攪拌器攪拌過(guò)夜(約12 h),得到純化的含低濃度咪唑的目標(biāo)蛋白質(zhì)。

1.2.4目標(biāo)蛋白質(zhì)和糖蛋白肽段的確證與定量

利用Bradford方法對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳方法評(píng)估蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及純度。利用Nanodrop對(duì)富集到的糖肽進(jìn)行定量分析。

1.2.5凝集素免疫印跡

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或全蛋白提取液用SDS-PAGE分離,然后轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。PVDF膜置于封閉液(1×Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS), 0.05%(v/v)吐溫20, 5% (v/v) BSA)中,室溫封閉1 h。用含有0.05%(v/v)吐溫20的TBS (TBST)溶液清洗后,按1∶5 000體積比加入生物素化的Gal3C或Tetra-Gal3C或植物凝集素,4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST清洗后,按體積比1∶5 000加入HRP-鏈霉親和素,室溫孵育1 h。TBST清洗后,加入DAB或ECL試劑進(jìn)行顯影。

1.2.6凝集素柱制備和糖蛋白富集

加200 μL的鏈霉親和素瓊脂糖小球到旋轉(zhuǎn)柱中,用200 μL預(yù)冷的PBS平衡柱子2次。加入500 μg的Gal3C或Tetra-Gal3C, 4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育1 h固定目標(biāo)蛋白質(zhì),即為凝集素親和柱。用注射器推壓收集未結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)并用PBS洗滌2次。

加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或全蛋白提取液(HepG2細(xì)胞用PBS和0.1%(v/v)Triton X-100重懸,使用超聲破碎提取的全蛋白溶液)到該凝集素親和柱中,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。置于冰上自然沉淀,注射器推壓收集未結(jié)合蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。用400 μL的PBS洗滌非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。加100 μL的8 mol/L尿素溶液到該凝集素親和柱中洗脫糖蛋白,37 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min。用注射器推壓收集洗脫液,重復(fù)洗脫一次,洗脫液包含富集的糖蛋白。

1.2.7糖蛋白酶切

將洗脫液加入到30 kD的超濾管中,加200 μL的8 mol/L尿素溶液,14 000 g下離心10 min。加入終濃度20 mmol/L的二硫蘇糖醇,在37 ℃還原反應(yīng)4 h,之后加入終濃度50 mmol/L的碘乙酰胺,室溫暗處反應(yīng)30 min。用200 μL的50 mmol/L碳酸氫銨替換溶液。更換新的套管,按胰蛋白酶和糖蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶,在37 ℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)過(guò)夜,14 000 g下離心10 min,收集酶切肽段。真空冷凍干燥肽段,用0.1%(v/v)甲酸復(fù)溶后取500 ng進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.8質(zhì)譜分析

生物質(zhì)譜儀為串聯(lián)質(zhì)譜Q-Exactive HF。反相色譜直噴柱采用Magic C18柱(內(nèi)徑150 μm,柱長(zhǎng)12 cm, C18填料直徑為3 μm)。然后利用流動(dòng)相A液為含有0.1%(v/v)甲酸的超純水,B液為含有0.1%(v/v)甲酸的純乙腈,線(xiàn)性梯度為6%B～32%B,流速0.6 μL/min,進(jìn)行78 min的液相色譜分離,隨后進(jìn)Q-Exactive HF質(zhì)譜檢測(cè)。Q-Exactive HF質(zhì)譜檢測(cè)條件:碎裂模式為高能碰撞解離模式(HCD),電離方式為納升級(jí)電噴霧電離(Nano-ESI),采用正離子模式進(jìn)行掃描,電離電壓采用默認(rèn)設(shè)置,一級(jí)質(zhì)譜離子掃描的范圍為300～1 400 Da,分辨率為120 000,自動(dòng)增益控制(AGC)設(shè)置為3×106,最大注入時(shí)間(IT)設(shè)置為80 ms;二級(jí)質(zhì)譜Top N設(shè)置為20, AGC設(shè)置為5×104,最大IT設(shè)置為45 ms,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為12 s,質(zhì)量數(shù)據(jù)由XCalibur進(jìn)行實(shí)時(shí)采集。

1.2.9數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜分析獲得的RAW文件使用MaxQuant軟件(1.5.3.8版)進(jìn)行分析。參數(shù)設(shè)置:酶切方式為T(mén)rypsin,最大漏切位點(diǎn)為2。固定修飾設(shè)置為Carboxyamidomethylation (C);可變修飾設(shè)置為Acetyl (Protein N-term)、Oxidation (M);其他參數(shù)均為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組半乳糖凝集素-3的表征

重組構(gòu)建了含有CRD結(jié)構(gòu)域的人源半乳糖凝集素-3,依據(jù)CRD結(jié)構(gòu)域數(shù)目分別命名為Gal3C和Tetra-Gal3C。為了更好地分離純化重組凝集素蛋白質(zhì),在兩種凝集素蛋白質(zhì)上均構(gòu)建了兩個(gè)His標(biāo)簽,便于使用鎳柱(Ni-NTA-Agarose)分離純化。同時(shí),還構(gòu)建了一個(gè)由15個(gè)氨基酸殘基組成的Avi標(biāo)簽,為固定化到鏈霉親和素瓊脂糖小球提供專(zhuān)一性結(jié)合位點(diǎn)[18]。Gal3C含有199個(gè)氨基酸,大約為22.5 kD; Tetra-Gal3C含有639個(gè)氨基酸,大約為71.1 kD。如圖1a所示,通過(guò)鎳柱分離純化后,獲得了高純度的重組半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C,純度大于95%。為了評(píng)估重組半乳糖凝集素與鏈霉親和素的特異親和力,選取了HRP-鏈霉親和素作為抗體進(jìn)行了免疫印跡分析[19]。如圖1b所示,重組半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C與HRP-鏈霉親和素發(fā)生明顯的相互作用,即Gal3C和Tetra-Gal3C成功發(fā)生了生物素化。

圖 1 重組半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C的SDS-PAGE和免疫印跡圖

圖 2 重組半乳糖凝集素結(jié)構(gòu)和凝集素親和柱富集糖蛋白/糖肽流程示意圖

2.2 重組半乳糖凝集素糖蛋白/糖肽富集流程

如圖2所示,Gal3C僅含有一個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域,而Tetra-Gal3C通過(guò)聚甘氨酸接頭連接了4個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域。同時(shí),Gal3C和Tetra-Gal3C均含有兩個(gè)His標(biāo)簽和一個(gè)Avi標(biāo)簽,并發(fā)生生物素化修飾。當(dāng)Gal3C和Tetra-Gal3C與鏈霉親和素瓊脂糖小球混合孵育時(shí),由于生物素環(huán)形結(jié)構(gòu)中的咪唑酮環(huán)能與鏈霉親和素發(fā)生共價(jià)結(jié)合[20],致使重組凝集素特異性地固定于鏈霉親和素瓊脂糖小球上,制作成凝集素親和柱,進(jìn)而可應(yīng)用于糖蛋白/糖肽的親和富集。

2.3 重組半乳糖凝集素親和富集標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白

人源的半乳糖凝集素-3偏向于識(shí)別并結(jié)合N-糖蛋白,特別是含有N-乙酰乳糖胺修飾的糖蛋白[21]。為了驗(yàn)證重組凝集素是否具有相似的糖蛋白富集特性,利用6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,包括去唾液酸的胎球蛋白A(AF)、牛血清白蛋白(BSA)、胎球蛋白A(F)、馬心肌紅蛋白(Mb)、核糖核酸酶B(RB)、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白(T)。其中,AF、F、RB和T是N-糖蛋白,BSA和Mb是非糖蛋白。如圖3a所示,6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的純度均在90%以上,但由于BSA與AF和F的分子量較為接近,最終采用了5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的混合物進(jìn)行糖蛋白富集分析,不包括BSA。

為了評(píng)價(jià)重組凝集素對(duì)N-糖蛋白的特異性識(shí)別和結(jié)合能力,進(jìn)行了凝集素免疫印跡分析,即將生物素化的重組半乳糖凝集素-3(Gal3C和Tetra-Gal3C)作為“一抗”,與轉(zhuǎn)印到PVDF膜上的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合孵育,洗滌之后與HRP-鏈霉親和素孵育,最后用DAB或ECL試劑盒顯色。如圖3b和3c所示,Gal3C和Tetra-Gal3C均能結(jié)合N-糖蛋白AF、F、RB和T,而不與非糖蛋白BSA和Mb結(jié)合,表明生物素化的重組凝集素作為“一抗”檢測(cè)靈敏度高,且具有N-糖蛋白的特異性識(shí)別和結(jié)合能力。

為了評(píng)估重組凝集素親和柱的糖蛋白富集效能,將Gal3C和Tetra-Gal3C固定到鏈霉親和素瓊脂糖小球上,利用形成的重組凝集素親和柱去富集5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物中的糖蛋白。如圖3d和3e所示,5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白(AF、F、Mb、RB和T)具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量,其混合物能夠在SDS-PAGE膠上清晰地分為5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)條帶。經(jīng)過(guò)Gal3C和Tetra-Gal3C凝集素親和柱富集后,3種N-糖蛋白(AF、F和T)都得到了明顯的富集,特別是AF糖蛋白。結(jié)果表明Gal3C和Tetra-Gal3C凝集素親和柱對(duì)N-糖蛋白具有特異的識(shí)別和結(jié)合能力。此外,在洗滌液中也鑒定到了5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)條帶(見(jiàn)圖3d和3e),這是因?yàn)槊糠N蛋白質(zhì)的糖基化修飾程度并不相同,未發(fā)生修飾或弱結(jié)合的蛋白質(zhì)都被洗滌出來(lái)。同時(shí),進(jìn)一步驗(yàn)證了Tetra-Gal3C凝集素親和柱對(duì)3種N-糖蛋白的親和性。如圖3f所示,Tetra-Gal3C對(duì)3種N-糖蛋白(AF、F和T)都表現(xiàn)出了良好的親和特性,特別是AF糖蛋白。綜上所述,這些結(jié)果都表明重組凝集素親和柱能特異性地結(jié)合N-糖蛋白,具有應(yīng)用于糖蛋白質(zhì)組富集分析的潛能。

圖 3 重組半乳糖凝集素結(jié)合糖蛋白能力分析

圖 4 植物凝集素的糖蛋白親和性評(píng)估

為了評(píng)估重組Tetra-Gal3C凝集素對(duì)糖鏈的親和特異性,選用了4種植物凝集素對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)進(jìn)行了免疫印跡分析[22,23],包括伴刀豆凝集素A(ConA)、麥胚凝集素(WGA)、小扁豆凝集素(LCA)、雞冠珊瑚樹(shù)凝集素(ECA)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-13,24], ConA可特異性地與高甘露糖型糖鏈親和作用,WGA可特異性地與β1-4或β1-2連接的N-乙酰葡萄糖胺及唾液酸糖鏈親和作用,LCA可特異性地與高甘露糖型糖鏈親和作用,ECA則特異性地與末端為半乳糖或N-乙酰半乳糖胺糖鏈親和作用。如圖4所示,F蛋白傾向與WGA親和作用,表明其唾液酸糖鏈較多;AF蛋白傾向與ECA親和作用,表明其含有半乳糖或N-乙酰半乳糖胺糖鏈;RB蛋白和T蛋白能與4種植物凝集素結(jié)合,表明含有多種糖鏈;而B(niǎo)SA和Mb蛋白均不與植物凝集素結(jié)合,表明這兩類(lèi)蛋白都不含有糖鏈。綜上所述,重組的人源凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C與植物凝集素ECA類(lèi)似,兩者都能與含有N-乙酰半乳糖胺修飾的AF蛋白發(fā)生親和作用,并且具有較高的選擇性和特異性,因此可適用于此類(lèi)糖蛋白/糖肽的富集。

圖 5 HILIC, Gal3C和Tetra-Gal3C材料的糖肽富集能力對(duì)比圖(n=3)

圖 6 重組半乳糖凝集素親和柱在HepG2細(xì)胞全蛋白裂解液中糖蛋白富集分析的應(yīng)用

為了進(jìn)一步評(píng)估重組凝集素的糖蛋白/糖肽富集能力,將50 μg的AF肽段分別使用糖肽富集材料HILIC、重組凝集素材料Gal3C和Tetra-Gal3C進(jìn)行富集分析。通過(guò)定量比較分析,發(fā)現(xiàn)凝集素材料Tetra-Gal3C能夠富集到更多的AF蛋白的糖肽,約為凝集素材料Gal3C的1.5倍和HILIC材料的2倍(見(jiàn)圖5)。這一結(jié)果表明,Tetra-Gal3C由于含有4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的CRD結(jié)構(gòu)域,因而具有更高的糖肽負(fù)載量,能夠結(jié)合更多的糖肽。然而,Tetra-Gal3C的4個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域排列緊密,導(dǎo)致富集的糖蛋白或糖肽在空間結(jié)構(gòu)上存在一定的位阻排斥效應(yīng),因此富集的糖肽含量不足Gal3C的4倍。同時(shí),也發(fā)現(xiàn)凝集素材料對(duì)AF蛋白的糖肽富集率均高于HILIC,表明重組凝集素材料對(duì)N-乙酰半乳糖胺糖肽具有更高的親和性。

2.4 重組凝集素在復(fù)雜樣本中糖蛋白/糖肽富集中的應(yīng)用

進(jìn)一步評(píng)估了重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C在復(fù)雜樣本中富集糖蛋白/糖肽的能力。如圖6a和6b所示,重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C從HepG2細(xì)胞全蛋白(H)中富集了大量的糖蛋白。同時(shí),觀測(cè)到大量非糖蛋白未被重組凝集素富集,表明重組凝集素具有糖蛋白親和特異性。然后利用重組凝集素作為“一抗”進(jìn)行免疫印跡分析,通過(guò)ECL和DAB顯影,發(fā)現(xiàn)重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C能夠明顯地與大量糖蛋白結(jié)合,且兩種凝集素結(jié)合的蛋白非常類(lèi)似,如圖6c和6d所示。其中Tetra-Gal3C對(duì)某些特異的糖蛋白表現(xiàn)出了更強(qiáng)的親和能力,導(dǎo)致顯影更加明顯。

利用空載的鏈霉親和素瓊脂糖小球作為空白對(duì)照,進(jìn)一步分析了重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C親和柱的糖蛋白富集能力。與對(duì)照組相比,重組凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C親和柱均從HepG2細(xì)胞全蛋白中特異性的富集到了208種UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的糖蛋白。Tetra-Gal3C對(duì)其中的106個(gè)蛋白表現(xiàn)出了更高親和性,富集到的糖蛋白峰度明顯大于Gal3C富集到的糖蛋白峰度(>1.5倍,見(jiàn)圖7)。其中,SLC7A1、ABCC4和NPC1 3個(gè)蛋白的富集倍數(shù)差高達(dá)9倍。相對(duì)Tetra-Gal3C而言,僅有44個(gè)糖蛋白表現(xiàn)出對(duì)Gal3C更高的親和性(<0.75倍,見(jiàn)圖7)。通過(guò)熱圖對(duì)比分析150個(gè)差異富集糖蛋白的蛋白質(zhì)峰度,也發(fā)現(xiàn)兩種材料對(duì)這150個(gè)糖蛋白有特異的親和性(見(jiàn)圖8)。由此我們認(rèn)為,Tetra-Gal3C由于具有四重串聯(lián)的CRD結(jié)構(gòu)域,相對(duì)于僅有一個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域的Gal3C而言,具有更高的糖鏈負(fù)載量,能夠富集更多的糖蛋白?？臻g結(jié)構(gòu)原因可能導(dǎo)致Tetra-Gal3C對(duì)少量糖蛋白的富集能力相對(duì)減弱,因此Gal3C表現(xiàn)出了更高的富集特性?？傮w說(shuō)來(lái),這一結(jié)果表明重組凝集素親和柱具有從復(fù)雜生物樣本中富集糖蛋白/糖肽的潛能,可應(yīng)用于復(fù)雜樣本的糖蛋白質(zhì)組富集分析。

圖 7 Tetra-Gal3C和Gal3C糖蛋白富集能力的對(duì)比

圖 8 Tetra-Gal3C和Gal3C差異富集的糖蛋白峰強(qiáng)度熱圖

3 結(jié)論

半乳糖凝集素-3是半乳糖凝集素家族中的重要成員,具有廣泛的生物學(xué)功能,參與細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程[25-27]。本文聚焦于半乳糖凝集素-3的CRD結(jié)構(gòu)域在糖蛋白質(zhì)組富集分析中的應(yīng)用。首先,利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了一組含有一個(gè)或四個(gè)串聯(lián)重復(fù)CRD結(jié)構(gòu)域的人源半乳糖凝集素-3: Gal3C和Tetra-Gal3C。其次,通過(guò)生化表征和標(biāo)準(zhǔn)蛋白評(píng)估,證明了重組人源半乳糖凝集素具有糖鏈識(shí)別和結(jié)合的特異性,尤其是對(duì)N-乙酰半乳糖胺修飾的糖蛋白/糖肽具有顯著的親和特性。最后,將其固定化到鏈霉親和素瓊脂糖小球制作成凝集素親和柱,應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本中的糖蛋白/糖肽富集分析,并取得了良好的富集效果。因此,證明人源重組凝集素具有富集糖蛋白/糖肽的能力,可適用于復(fù)雜生物樣本的糖蛋白質(zhì)組富集分析。

綜上所述,本文建立了人源重組半乳糖凝集素Gal3C和Tetra-Gal3C的表達(dá)和制備方法,為人源半乳糖凝集素的生物功能研究提供了可能的實(shí)驗(yàn)材料。同時(shí),基于重組哺乳動(dòng)物凝集素糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域,提供了一種新的糖蛋白質(zhì)組富集策略,有望推進(jìn)復(fù)雜生物體系糖蛋白質(zhì)組的研究。