柴成梁， 常曉嬌， 王楠希， 孫 晶， 孫長(zhǎng)坡

(國(guó)家糧食和物質(zhì)儲(chǔ)備局科學(xué)研究院， 北京 100037)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是世界上污染范圍最廣的一種鐮刀菌毒素，具有強(qiáng)烈的雌性激素毒性及致癌性，嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康[1-3]，其主要污染的糧食作物包括玉米、大麥、小麥、高粱和黑麥等[4-6]。

ZEN的化學(xué)名稱為6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β-雷鎖酸內(nèi)酯。ZEN能引起人畜中毒的原因是其結(jié)構(gòu)與雌性激素雌二醇(estradiol)的結(jié)構(gòu)相似，能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合動(dòng)物細(xì)胞膜上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)[7-10]。此生物活性主要是由ZEN的內(nèi)酯鍵結(jié)構(gòu)及4位碳原子的羥基引起[11]，因此，破壞這些結(jié)構(gòu)可視為對(duì)ZEN的有效脫毒[12]。粉紅粘帚霉IFO 7063被發(fā)現(xiàn)可催化打開(kāi)ZEN的內(nèi)酯鍵[13]，并且，負(fù)責(zé)此催化反應(yīng)的內(nèi)酯酶基因ZHD101被成功克隆[14]。目前，ZHD101蛋白的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析出，明確了ZHD101與ZEN分子的結(jié)合方式[15]，為ZHD101在消減糧食中的ZEN污染提供了重要基礎(chǔ)。然而，應(yīng)用ZHD101水解酶降解糧食中的ZEN毒素，常涉及高溫、高鹽、強(qiáng)酸等條件，在如此苛刻的工業(yè)環(huán)境下，ZHD101酶活性極低甚至消失，無(wú)法消除糧油食品中的ZEN污染。因此，需要發(fā)掘新的ZEN降解微生物以及降解酶，明確此類降解酶的催化機(jī)理，提高酶的催化活性及在工業(yè)條件下的適應(yīng)性，為有效消除糧食中的ZEN污染提供基礎(chǔ)。本研究旨在開(kāi)發(fā)新的ZEN高效降解酶，并試圖理解此類降解酶的催化反應(yīng)機(jī)理，為消減ZEN提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集

篩選ZEN降解菌的樣品是采集于四川省的小麥麩皮，樣品采集后置于4℃冰箱中保存、備用；篩選ZEN降解菌用的毒素管為含有10 μg ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)品的2 mL EP管。

1.1.2試劑及培養(yǎng)基

用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物由金唯智生物科技有限公司合成；用于分子克隆的酶購(gòu)買(mǎi)于Invitrogen公司；ZEN標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司；培養(yǎng)基及其他生化試劑購(gòu)自中科天銳(北京)科技有限公司。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)：MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.066 g，Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO41.52 g，加去離子水定容至1 L，調(diào)pH值至6.8。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去離子水定容至1 L，于121 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂粉。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮沸20～30 min，用6層紗布過(guò)濾，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000 mL，分裝， 115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；e2695型高效液相色譜儀、2475型熒光檢測(cè)器、xbridge C18型色譜柱，美國(guó)Waters公司； 6510型Q-TOF LC/MS，美國(guó)Agilent公司；親和層析柱，中科天銳(北京)科技有限公司；核酸蛋白電泳儀及凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司；PCR儀，美國(guó)ABI公司；恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，賽默飛世爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1ZEN降解菌的篩選

稱取小米麩皮樣品5 g，加到離心管(50 mL)中，加入30 mL無(wú)菌水振蕩混勻，使樣品中的微生物充分懸浮于水中，放于離心管架上靜置1 h；在超凈工作臺(tái)中吸取上清液100 μL于ZEN毒素管中，加入400 μL MSM培養(yǎng)基，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)15 d后，吸取100 μL菌液于新的ZEN毒素管中，再培養(yǎng)15 d，如此富集培養(yǎng)3次。吸10 μL培養(yǎng)的菌液，涂布MSM平板，30 ℃培養(yǎng)；挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落于ZEN毒素管中培養(yǎng)15 d，用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)菌株對(duì)ZEN的降解效果。

1.3.2ZEN降解菌株的基因組測(cè)序

采用第三代納米孔單分子測(cè)序技術(shù)(測(cè)序平臺(tái)： Pacific Biosciences RS II)，對(duì)降解菌株的全基因序列信息進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果的組裝與注釋，得到了該降解菌株的基因組編碼序列信息。以ZHD101序列為模板，與測(cè)序得到的基因組編碼序列進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3.3ZHD795重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

委托上海英濰捷基生物公司對(duì)ZHD795基因進(jìn)行化學(xué)全合成。以合成的ZHD795基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增。利用核酸瓊脂糖凝膠電泳回收Z(yǔ)HD795基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后連入PET30a載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽(yáng)性重組子。

1.3.4ZHD795重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

擴(kuò)大培養(yǎng)ZHD795重組子，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，過(guò)夜表達(dá)ZHD795蛋白。高速離心收集菌體，加入重懸液后超聲破碎，高速離心后去除菌體，上清液利用親和層析純化ZHD795蛋白，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行ZHD795蛋白的表達(dá)純化分析。

1.3.5ZEN降解酶活性測(cè)定

取純化后的ZHD795蛋白，加入到ZEN毒素管中，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，反應(yīng)3 h后，終止反應(yīng)，用高效液相色譜檢測(cè)，根據(jù)ZEN色譜峰的變化來(lái)判斷ZHD795蛋白對(duì)ZEN是否具有降解活性；同時(shí)，以水代替ZHD795蛋白作為反應(yīng)對(duì)照。經(jīng)由HPLC檢測(cè)，對(duì)照樣品與反應(yīng)樣品的ZEN色譜峰面積之差，即為由ZHD795蛋白催化反應(yīng)掉的ZEN分子。

1.3.6ZHD795與ZHD101對(duì)ZEN降解活性的比較

將表達(dá)純化的ZHD795與ZHD101降解酶稀釋至相同濃度，按照已構(gòu)建好的酶活反應(yīng)體系進(jìn)行催化降解反應(yīng)；經(jīng)由HPLC檢測(cè)，比較2個(gè)蛋白酶對(duì)ZEN的降解活性高低。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZEN降解菌株活性分析

從四川省采集的小麥麩皮樣品，在以ZEN為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，經(jīng)HPLC檢測(cè)，得到一株ZEN降解菌，如圖1。

圖1 篩選得到的ZEN降解菌株Fig.1 Screening of microorganism degrading ZEN

2.2 ZEN降解菌株基因組序列分析

通過(guò)對(duì)降解菌株的全基因組測(cè)序，組裝得到了38.98 Mb的序列信息，注釋得到12 555個(gè)編碼基因序列；將此基因組序列信息與ZHD101進(jìn)行比對(duì)，得到了同源性為62%的同源蛋白ZHD795。

2.3 ZHD795蛋白酶的表達(dá)純化分析

ZHD795基因通過(guò)PCR方法擴(kuò)增后，運(yùn)用核酸瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離回收，結(jié)果如圖2。

1泳道是目的基因ZHD；M為DNA Marker。圖2 ZHD795基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ZHD795 gene

將ZHD795基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21進(jìn)行ZHD795蛋白表達(dá)，運(yùn)用親和層析法純化目的蛋白，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行ZHD795蛋白的表達(dá)純化分析，結(jié)果如圖3。

1泳道是表達(dá)ZHD795蛋白的菌體超聲破碎后的樣品；2泳道是高速離心后的上清樣品；3、4泳道是從Ni-NTA親和柱上洗脫下來(lái)的樣品；M是Protein Marker。圖3 ZHD795蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of ZHD795 protein

2.4 ZHD795蛋白對(duì)ZEN的降解活性分析

取ZHD795蛋白液100 μL，加入到ZEN毒素管中作為反應(yīng)組，以水代替ZHD795蛋白加入ZEN毒素管作為對(duì)照組，在37 ℃培養(yǎng)箱反應(yīng)6 h后，終止反應(yīng)。HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖4。圖4中對(duì)照組樣品在保留時(shí)間為8.715 min處有強(qiáng)吸收峰，而反應(yīng)組樣品基本無(wú)ZEN目標(biāo)峰檢出。

在保留時(shí)間8.715 min處，無(wú)吸收峰的是反應(yīng)組樣品，有吸收峰的是對(duì)照組樣品。圖4 HPLC檢測(cè)ZHD795對(duì)ZEN的降解活性Fig.4 Detection of degradation activity of ZHD795 to ZEN determined by HPLC

將ZHD795蛋白和ZHD101蛋白均稀釋至質(zhì)量濃度為2.0×10-3mg/mL，加入ZEN毒素管中反應(yīng)30 min后終止反應(yīng)。HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。經(jīng)吸收峰面積計(jì)算，在30 min內(nèi)，ZHD795對(duì)ZEN的降解率為96%，而ZHD101對(duì)ZEN的降解率為37%；ZHD795對(duì)ZEN的降解酶活為ZHD101的2.5倍。

圖5 ZHD795與ZHD101對(duì)ZEN降解活性比較Fig.5 Comparation of degradation activity of ZEN by ZHD795 and ZHD101

3 結(jié) 論

ZEN降解酶ZHD101能催化打開(kāi)ZEN分子的內(nèi)酯鍵，降解產(chǎn)物無(wú)毒性，是具有應(yīng)用前景的ZEN降解酶。如何提高ZEN降解酶的催化活性及在工業(yè)條件下的適應(yīng)性，是需要解決的問(wèn)題。

本研究通過(guò)大量的篩選工作，在小麥麩皮樣品中篩選得到一株能高效降解ZEN毒素的微生物菌株；通過(guò)第三代納米孔單分子測(cè)序技術(shù)進(jìn)行該菌株的全基因組測(cè)序，得到了該菌株的全基因組序列信息；通過(guò)與ZEN降解酶ZHD101進(jìn)行序列比對(duì)，得到了一個(gè)同源性為62%的基因ZHD795，通過(guò)構(gòu)建ZHD795基因原核表達(dá)體系，重組表達(dá)純化得到ZHD795蛋白。構(gòu)建ZHD795蛋白對(duì)ZEN的降解活性檢測(cè)體系，檢測(cè)結(jié)果表明ZHD795蛋白可降解ZEN毒素分子。通過(guò)ZHD795與ZHD101對(duì)ZEN的降解活性比較，明確了ZHD795對(duì)ZEN的降解酶活為ZHD101的2.5倍，從而得到了一個(gè)高效的ZEN降解酶。

ZHD101屬于α/β水解酶家族，其活性中心包含α/β水解酶典型的催化三聯(lián)體——酸- 堿- 親核三聯(lián)體，即Ser102- His242- Glu126，此催化三聯(lián)體殘基在一級(jí)序列中離得很遠(yuǎn)，但在三維結(jié)構(gòu)中它們折疊到一起，發(fā)揮催化活性。通過(guò)一級(jí)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ZHD795也存在此催化三聯(lián)體，下一步工作要解析ZHD795蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)，解析其催化反應(yīng)機(jī)理，并與ZHD101進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)，揭示造成2個(gè)降解酶對(duì)ZEN分子降解活性存在高低差異的原因，明確此類降解酶與ZEN的結(jié)合方式和催化特點(diǎn)，進(jìn)一步通過(guò)分子改造提高此類降解酶對(duì)ZEN的催化活性及工業(yè)條件的適應(yīng)性，為消減糧食及其副產(chǎn)物中的ZEN污染提供切實(shí)可行的技術(shù)支撐。