劉宏毅，陳慧潔，李慧敏，葉小真，馮麗貞，郭朦朦

(福建農林大學 a 林學院，b 金山學院，福建 福州 350002)

在大多數原核生物和所有真核生物中，鐵元素是各種生命活動的必需元素。地殼中鐵元素儲量豐富，但其難溶性大大限制了真菌對鐵的直接吸收。在生境中鐵元素含量較低時，大多數微生物和部分植物通過分泌鐵載體與Fe3+結合為鐵載體-鐵化合物來獲取鐵元素[1]。大多數真菌存在4種異羥肟酸型鐵載體，分別為鐮孢氨酸、糞生素、鐵色素和羅丹明酸，其主要由非核糖體肽合成酶(NRPSs，non-ribosomal peptide synthetases)來合成[2]。鐵載體-鐵轉運蛋白(Siderophore iron transporter，SIT)屬于MFS(Major facilitator superfamily)超家族，在缺鐵生境下通過轉運鐵載體-鐵化合物為微生物的生長發(fā)育提供鐵元素。SIT轉運蛋白具有典型的MFS結構域，家族成員大多數由400～600個氨基酸殘基組成，N端和C端均位于胞內,MFS蛋白的二級結構大多含有12個跨膜α螺旋，僅少數含有6，14或24個[3-4]，目前已知的SIT轉運蛋白均含有14個跨膜α螺旋，多出的2個跨膜螺旋是由胞內中間的環(huán)狀區(qū)(loop)插入膜中產生的。因此，雖然少數蛋白成員含有的跨膜α螺旋數目不同，但是并不影響MFS超家族整體的蛋白折疊方式,即MFS折疊[5]。MFS轉運蛋白的轉運機制由搖桿開關和門控運輸理論組成[6-8]，MFS蛋白的N端或C端的跨膜螺旋圍繞著底物結合位點一側關閉一側開放以進行轉運。SIT轉運蛋白作為鐵載體-鐵化合物的運輸載體發(fā)揮著重要作用，如禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)FgSit1基因編碼的SIT轉運蛋白負責調控鐵載體-鐵化合物FC-Fe3+的吸收[9]，構巢曲霉(Aspergillusfumigatus)的SIT轉運蛋白MirB與鐵載體-鐵化合物三乙酰鐮孢氨酸的轉運有關[10]，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Arn1p轉運蛋白通過轉運生境中的鐵載體-鐵化合物來獲取鐵元素[11]。

桉樹焦枯病(Calonectriapseudoreteaudii)是熱帶和亞熱帶地區(qū)桉樹種植區(qū)危害最為嚴重的病害之一，嚴重威脅桉樹產業(yè)的發(fā)展[12]。桉樹焦枯病由麗赤殼屬(Calonectria)真菌引起，其無性態(tài)為帚梗柱孢屬(Cylindrocladium)真菌[13]。據統(tǒng)計，Calonectria現有集群13個共71種，其中Calonectriapseudoreteaudii是福建省內發(fā)現最早、分布最廣、致病力最強的病原菌株[14-16]。有研究發(fā)現，桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白在焦枯病菌侵染桉樹48 h時上調表達，可能在病原菌侵染寄主的過程中，CpSit1基因通過調控鐵載體-鐵化合物的轉運完成鐵元素的攝入，進而協助焦枯病菌在桉樹中的定植[17]。為了解CpSit1基因在桉樹焦枯病菌中是否為單拷貝基因，本研究通過多種生物信息學軟件在全基因組范圍內對焦枯病菌SIT蛋白家族進行鑒定，并對其編碼基因、結構域、跨膜螺旋、亞細胞定位等進行分析和功能預測，進一步通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行多菌種比較分析，并通過qPCR分析SIT轉運蛋白在焦枯病菌侵染桉樹48 h后的表達情況，以期為揭示SIT轉運蛋白家族在焦枯病菌鐵元素攝入機制及鐵載體-鐵轉運蛋白在焦枯病菌侵染桉樹過程中所扮演的角色奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 基因組序列來源

桉樹焦枯病菌(Calonectriapseudoreteaudii,菌株：YA51)基因組NCBI檢索號為MOCD01000000。禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum,菌株：PH-1)、粗糙脈胞菌(Neurosporacrassa，菌株：OR74A)、稻瘟菌(Magnaportheoryzae,菌株：70-15)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea，菌株：B05-10)的基因組數據及蛋白序列數據,均下載自Broad Institute(www.broadinstitute.org/)數據庫。

1.2 試驗方法

1.2.1 SIT轉運蛋白的鑒定 從NCBI數據庫中下載所有真菌SIT轉運蛋白的蛋白序列，通過MAFFT軟件進行多重比較；然后通過HMMER軟件(http://hmmer.org/)的hmmbuild功能構建隱馬可夫(HMM,Hidden Markov Model)模型，用hmmsearch功能將其與桉樹焦枯病菌、禾谷鐮刀菌、粗糙脈胞菌、稻瘟菌和灰葡萄孢的蛋白序列庫進行比對，E值設定為1×10-10；進一步用hmmsearch分析結果再次構建隱馬可夫模型后用hmmsearch進行迭代搜索；最后通過與TCDB(Transporter Classification Database, http://www.tcdb.org/)數據庫進行Blast比對，最終獲得這5個菌種的SIT轉運蛋白。

1.2.2 結構域預測 采用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)在線分析功能進行SIT轉運蛋白的結構域預測。

1.2.3 跨膜螺旋預測 采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對SIT轉運蛋白的跨膜螺旋進行預測。

1.2.4 亞細胞定位預測 采用WoLF PSORT在線工具(https://wolfpsort.hgc.jp/)對SIT轉運蛋白進行亞細胞結構定位預測。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 采用mafft軟件[18]對禾谷鐮刀菌、稻瘟菌、灰葡萄孢、粗糙脈胞菌和桉樹焦枯病菌的SIT轉運蛋白進行多重比對，以禾谷鐮刀菌的DHA14(drug:H+antiporter 14 spanner)蛋白TRI102為外群，然后用Gblock軟件去除冗余序列，最后用Neighbor-Joining法通過MEGA7.0[19]構建其系統(tǒng)發(fā)育樹。bootstrap檢測值設為1 000次，其余參數均為系統(tǒng)默認值，對重復率小于50%的分支進行合并。

1.2.6 SIT基因表達分析 基于焦枯病菌侵染桉樹48 h的數字基因表達譜數據(Digital Gene Expression profiling，DGE)，獲得桉樹焦枯病菌SIT基因的轉錄表達情況[20]，并將其表達情況標注在系統(tǒng)發(fā)育樹中。采用與DGE分析相同的方法制備樣品，然后進行總RNA提取、PCR反轉錄及實時熒光PCR，其中總RNA提取、反轉錄PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)、實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。采用Talent qPCR PreMix試劑盒進行qRT-PCR，反應體系為：2×Talent qPCR Mix 10.0 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，cDNA模板1.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，并加RNase-Free ddH2O至20 μL。采用Beacon Design 7.9軟件進行引物設計(表1)，委托生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計算焦枯病菌SIT基因的表達量。

表1 桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白的引物Table 1 Primers of SIT transporters in Calonectria pseudoreteaudii

2 結果與分析

2.1 SIT轉運蛋白的鑒定

通過對桉樹焦枯病菌全基因組進行hmmsearch分析，從14 355條序列中共鑒定出16個SIT轉運蛋白(表2)，約占總編碼蛋白的0.11%。序列分析發(fā)現，其蛋白序列長度大多數為400～603個氨基酸，編碼這些蛋白序列的ORF(Open reading frame)閱讀框位于不同的基因組支架(Scaffold)上。桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白的蛋白序列與TCDB數據庫比對結果(表2)顯示，其主要分為13個鐵-鐵載體轉運蛋白(Ferri-siderophore transporter，TCID:2.A.1.16.7)、2個鐵載體-鐵:H+同向轉運蛋白(Siderophore-iron:H+symporter，TCID：2.A.1.16.1)和1個鐵載體-鐵轉運蛋白(Siderophore iron transporter，TCID:2.A.1.16.6)。亞細胞定位預測結果(表2)顯示，除CpSit13轉運蛋白在內質網上外，其余均在細胞膜上。

2.2 結構域及跨膜螺旋分析

保守結構域分析發(fā)現，16個桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白均為MFS結構域(圖1)，其InterPro ID為IPR020846。SIT蛋白結構域長短不一，長度為24～524個氨基酸，其中CpSit4、CpSit8、CpSit10、CpSit11和CpSit13分為2段；CpSit1和CpSit5分為3段。CpSit1的2段長度較為接近的結構域的一致性為21%，CpSit5 的2段長度較為接近的結構域的一致性為23%，說明CpSit1和CpSit5轉運蛋白的結構域在進化晚期通過單個結構域復制而來的可能性較低。

表2 桉樹焦枯病菌SIT蛋白的相關信息Table 2 Information of siderophore-iron transporters in Calonectria pseudoreteaudii

圖1 桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白的結構域Fig.1 Conserved domains of Siderophore-iron transporters in Calonectria pseudoreteaudii

TMHMM分析(表2)發(fā)現，CpSit3含有12個跨膜螺旋，CpSit5、CpSit11和CpSit15均含有13個，CpSit7含有11個，CpSit8含有10個，其余均含有14個跨膜螺旋。此外，CpSit8的蛋白長度及結構域長度明顯小于其他SIT轉運蛋白，其跨膜螺旋數僅為10個，與典型SIT蛋白的跨膜螺旋數量不符，這可能是基因復制過程中結構遺失或基因組拼裝錯誤所致。雖然部分桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白的跨膜α螺旋數目不盡相同，但并不影響整體的蛋白折疊方式，其跨膜螺旋較為均勻地分布在N端和C端，為典型的MFS折疊。因此推測SIT蛋白與底物結合后，其N端或C端的跨膜螺旋圍繞著底物結合位點一側關閉一側開放進行轉運。以上結果表明，桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白結構特征較為保守，可能具有活性和功能。

2.3 不同物種間SIT轉運蛋白的比較

通過hmmsearch共從禾谷鐮刀菌、稻瘟菌、粗糙脈胞菌、灰葡萄孢和桉樹焦枯病菌中發(fā)現34個SIT轉運蛋白，其中禾谷鐮刀菌8個,稻瘟菌3個,粗糙脈胞菌2個,灰葡萄孢5個，而桉樹焦枯病菌有16個SIT轉運蛋白，存在明顯擴張。對上述SIT蛋白序列進行結構域分析，發(fā)現其結構域均為MFS結構域。

通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，發(fā)現其分支聚為3大類，分別為鐵載體-鐵:H+同向轉運蛋白、鐵載體-鐵轉運蛋白和外群TRI102蛋白，表明這些SIT轉運蛋白具有明顯的直系同源關系，來源于共同的祖先基因且在進化中十分保守。桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白在進化樹中分別聚在不同分支中，不存在單拷貝狀況。在禾谷鐮刀菌、稻瘟菌、粗糙脈胞菌、灰葡萄孢和桉樹焦枯病菌中，僅禾谷鐮刀菌和焦枯病菌分別含有2個鐵載體:H+同向轉運蛋白，這種在特定菌種中特有的SIT，可能暗示著與這2個菌種相應的生物學功能存在相關性，但具體情況還有待后續(xù)研究。

(1)紅色分支為鐵載體-鐵：H+同向轉運蛋白，藍色分支為鐵載體-鐵轉運蛋白，綠色分支為外群TRI102蛋白；(2)五邊形標記部分為桉樹焦枯病菌SIT蛋白轉錄表達情況，黃色代表上調，褐色代表下調，灰色代表表達不顯著(1)The red branch represents the Siderophore-iron:H+ Symporter,the blue branch represents the Siderohore iron transporter and the green color represents the outgroup TRI102 protein;(2)The pentagon is the expression of SIT protein in Calonectria pseudoreteaudii,the yellow represents up-regulation,the brown represents down-regulation and the gray represents false圖2 5種真菌SIT轉運蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenic analysis of Siderophore-iron transporters in 5 species

2.4 SIT基因表達分析

由表3可知，焦枯病菌侵染桉樹48 h后，CpSit1、CpSit3、CpSit5、CpSit8、CpSit9、CpSit10、CpSit11、CpSit14、CpSit15和CpSit16 10個基因上調表達。

表3 桉樹焦枯病菌SIT基因的相對轉錄表達量Table 3 Relative transcription levels of SIT genes in Calonectria pseudoreteaudii

結合系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析結果(圖2)可知，CpSit11和CpSit13聚在同一分支上，但是CpSit13表達不顯著，CpSit11上調且轉錄量較低；CpSit1和CpSit10，CpSit3、CpSit14和CpSit16，CpSit8和CpSit9，CpSit5和CpSit15分別聚在同一分支上，均為上調表達，且相對分支中其他基因具有較高的轉錄量。推測CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16 5個基因在焦枯病菌侵染桉樹的過程中具有較為重要的作用，CpSit3、CpSit9、CpSit10、CpSit11和CpSit15基因的作用可能相對較弱。CpSit2和CpSit4 2個基因下調表達，推測其可能在焦枯病菌侵染桉樹的過程中發(fā)揮負調控作用。CpSit6、CpSit7、CpSit12和CpSit13 4個基因表達不顯著，說明這4個基因在焦枯病菌侵染桉樹過程中作用較弱，或在所研究的范圍之外發(fā)揮其他作用。

為了驗證上述基因轉錄數據的準確性，利用實時定量PCR對其中10個SIT基因進行分析，結果如圖3所示。圖3顯示qPCR結果與轉錄組的一致性較高，CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16均具有較高的表達量，且CpSit2和CpSit4均下調表達。轉錄分析表明，CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16基因可能在焦枯病菌侵染桉樹48 h時發(fā)揮著較為重要的作用。

圖3 10個SIT基因相對轉錄表達量的比較Fig.3 Comparison of the relative expressions of SIT genes in Calonectria pseudoreteaudii

3 討論與結論

隨著病原真菌基因組測序工作的深入開展，越來越多的SIT轉運蛋白獲得鑒定，但是其在林木病原真菌中的鑒定尚無相關報道。為弄清SIT轉運蛋白在焦枯病菌侵染桉樹過程中所起的作用，本研究對桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白進行鑒定和比較，并對其結構域、跨膜螺旋、進化關系和基因表達等進行了分析，結果表明桉樹焦枯病菌共含有16個SIT轉運蛋白，分別是13個鐵-鐵載體轉運蛋白、2個鐵載體-鐵:H+同向轉運蛋白和1個鐵載體-鐵轉運蛋白。桉樹焦枯病菌SIT轉運蛋白的結構域、跨膜螺旋數與典型SIT蛋白的一致性較高，其跨膜螺旋折疊方式為典型的MFS折疊。由于SIT轉運蛋白結構的保守性，其可能具有相類似的功能和活性。

作為微生物鐵元素的攝入途徑之一，鐵載體-鐵化合物轉運途徑對微生物的生長發(fā)育起著重要作用。如玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)鐵載體合成基因NPS6的突變體在鐵饑餓生境下生長幾乎受到完全抑制，說明玉米大斑病菌的鐵載體-鐵化合物的吸收與其生長發(fā)育密切相關[21]。除此之外，鐵載體-鐵化合物的轉運還與病原真菌的致病性有關。Hof等[22]研究表明，稻瘟菌鐵載體合成酶基因SSM1被敲除后，其致病性明顯減弱；Oide等[23]研究表明，玉米小斑病(Cochliobolusheterostrophus)的鐵載體合成基因NPS6獲得敲除后致病力減弱。但SIT轉運蛋白作為鐵載體-鐵化合物的運輸途徑，與其致病性是否存在關聯尚未明確。有研究表明，輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)FIR1轉運蛋白在低鐵條件下上調表達，但與其致病性不存在關聯[24]。然而，蘋果腐爛病菌(Valsamali)共含有7個SIT轉運蛋白，其中3個在蘋果腐爛病菌侵染蘋果樹的過程中發(fā)生上調[25]。為了解桉樹焦枯病菌是否與其致病性存在關聯，本研究基于焦枯病菌侵染桉樹48 h轉錄組的基因表達譜，對16個SIT基因的表達情況進行分析，發(fā)現其中10個基因上調表達、2個下調表達、4個表達不顯著。通過系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析發(fā)現，雖然部分焦枯病菌SIT基因聚集在同一分支上，但其表達量存在較為明顯的差異。其中，CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16相對分支中的其他基因具有較高的轉錄量，由此推測CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16等5個基因在焦枯病菌侵染桉樹的過程中發(fā)揮著較為重要的作用，其余基因的作用可能相對較弱，或在所研究的范圍之外發(fā)揮其他作用。為驗證基因表達譜的準確性，本研究通過qPCR對其中10個SIT基因進行驗證，與基因表達譜具有較高的一致性，其中CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16等5個基因均有較高的表達量。

綜上所述，SIT轉運蛋白很可能與桉樹焦枯病菌基因的致病性密切相關。由于鐵元素攝取的重要性，后續(xù)可將SIT轉運蛋白作為毒力因子，通過基因敲除等分子生物學手段對其功能進行驗證，了解其在相應生物學過程中的具體作用，為抗焦枯病菌藥物的研制提供靶標基因。